Başlamak için, buzun üzerine 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin ve sırayla diğer bileşenlerle birlikte kollajen bir çözelti ekleyin. İyice karıştırmak için tüpü sallayın. Bir P10 pipeti kullanarak, pH'ı 7.3'e ayarlamak için karışım solüsyonunu sallarken damla damla bir molar sodyum hidroksit solüsyonu ekleyin.
Beş mililitrelik kollajen bir karışıma 1.25 mililitre bazal membran matrisi ekleyin ve çözeltiyi hafifçe karıştırın. Daha sonra 12 oyuklu bir plakayı iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Geniş delikli uçlar kullanarak, kollajen bir bazal membran matris karışımını 12 oyuklu plakaya yavaşça ekleyin.
İlk hidrojel katmanını katılaştırmak için 12 oyuklu plakayı 37 santigrat derece inkübatöre iki saat boyunca yerleştirin. Kalan kollajen bir bazal membran matris karışımını daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutun. Daha sonra yaklaşık 60 hücre agregasını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Ve tüpü beş dakika buz üzerinde soğutun. Bir P200 pipet ucu kullanarak, ortamı tüpten dikkatlice çıkarın. 1,5 mililitre kollajen bir bazal membran karışımını hücre agregalarına damla damla ekleyin ve yeniden süspanse etmek için geniş delikli bir P200 pipet ucu kullanarak hafifçe karıştırın.
İlk kat hidrojel ile plakayı inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın. Kürlenmiş hidrojel tabakasına 1,5 mililitre agrega süspansiyonu ekleyin ve agregaları eşit şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın. Plakayı iki saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Vasküler farklılaşma ortamını 37 santigrat derece su banyosunda 20 dakika önceden ısıtın. Her oyuğa iki mililitre ortam ekleyin ve hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kültürleyin. Ortamı her üç günde bir, önceden ısıtılmış taze vasküler farklılaşma ortamı iki ile değiştirin.
Organoidler, vasküler endotel hücrelerinin ve parazitlerin varlığını gösteren CD31, ERG1 ve PDGFR beta eksprese etti. Doku temizlendikten sonra vasküler ağlar tam mount immünofloresan mikroskobu ile görüntülendi. 17. günde boyanan olgun organoidler, jel bloğu içindeki sferoidleri kapsayan vasküler ağlar gösterdi.
28. günde alınan organoidler, radyal olarak genişlemek yerine sferoidlerin etrafını saran vasküler ağlara sahipti.
