Microwell 기술을 사용한 인간 혈관 오가노이드의 일관된 생성

시작하려면 50밀리리터 튜브를 얼음 위에 놓고 다른 성분과 함께 콜라겐 한 용액을 순차적으로 추가합니다. 튜브를 흔들어 잘 섞습니다. P10 피펫을 사용하여 혼합물 용액을 흔들면서 수산화나트륨 용액 1몰을 적가하여 pH를 7.3으로 조정합니다.

1.25 밀리리터의 기저막 매트릭스를 5 밀리리터의 콜라겐 1 혼합물에 넣고 용액을 부드럽게 섞는다. 그런 다음 12웰 플레이트를 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 넓은 보어 팁을 사용하여 콜라겐 1 기저 멤브레인 매트릭스 혼합물을 12웰 플레이트에 천천히 추가합니다.

12웰 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 2시간 동안 넣어 하이드로겔의 첫 번째 층을 응고시킵니다. 나중에 사용할 수 있도록 나머지 콜라겐 1 기저막 매트릭스 혼합물을 얼음에 보관하십시오. 그런 다음 약 60개의 세포 응집체를 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.

그리고 튜브를 얼음으로 5분 동안 식힙니다. P200 피펫 팁을 사용하여 튜브에서 배지를 조심스럽게 제거합니다. 1.5ml의 콜라겐 1 기저막 혼합물을 세포 응집체에 적하하고 넓은 구멍의 P200 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 혼합하여 재현탁합니다.

하이드로겔의 첫 번째 층이 있는 플레이트를 인큐베이터에서 생물안전 캐비닛으로 옮깁니다. 경화된 하이드로겔 층에 1.5ml의 골재 현탁액을 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 응집체가 고르게 분포되도록 합니다. 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%와 함께 2시간 동안 접시를 배양합니다.

혈관 분화 매체 2를 섭씨 37도의 수조에 20분 동안 미리 데웁니다. 각 웰에 2ml의 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 세포를 배양합니다. 3일마다 미리 따뜻해진 신선한 혈관 분화 배지 2로 배지를 교체합니다.

오가노이드는 CD31, ERG1 및 PDGFR 베타를 발현하여 혈관 내피 세포와 기생충의 존재를 나타냅니다. 혈관 네트워크는 조직 투명화 후 전체 마운트 면역형광 현미경을 통해 시각화되었습니다. 17일째에 염색된 성숙한 오가노이드는 겔 블록 내에 스페로이드를 캡슐화하는 혈관 네트워크를 보여주었습니다.

28일째에 채취한 오가노이드는 방사상으로 팽창하는 대신 스페로이드를 감싸고 있는 혈관 네트워크를 가지고 있었습니다.