Yazarlar elektroporasyon odasının bölümünde açıklayan inşaat ile Karen Lawrence ona yardım için teşekkür etmek istiyorum.

1. Elektroporasyon odasının İnşaatı <ol><li> 3.2mm aralıkla (Harvard Apparatus # 45-0105) (Şekil 2A) microslide, BTX Model 453 sipariş edin. Metal raylar tamamen slayt alt mühürlü olmalıdır. </li><li> Dremel aleti, plastik bir mikrosantrifüj tüp raf kapalı bir kolu kesmek için kullanın. Kolu 0.8cm uzunluğunda, yüksekliği 0.6cm, genişlik 0.3cm (Şekil 2B): Her aşağıdaki boyutları ile 5 küçük dikdörtgen parçalar halinde kesin. Bu plastik parçaları, yeniden kullanılabilir ayırıcılar microslide odasında ayrı ayrı kuyu kalıp kullanılacaktır. </li><li> Microslide metal raylar arasında eşit aralıklarla plastik ayırıcılar yerleştirin. Ayırıcılar (Şekil 2C) rahatça sığacak. </li><li> P200 pipet ucu kapalı Kes, 3ml şırınga ucu uygun ve% 100 silikon kauçuk akvaryum dolgu ile şırınga doldurun. Dolgu ile plastik ayırıcılar arasındaki boşlukları doldurun. Kabarcıklar mastik fiş ve microslide tabanı arasında oluşturduğu alt boşlukları doldurmak için emin olun. </li><li> Ayırıcılar yerinde tutulur, böylece plastik ayırıcılar tepesinde metal bir çubuk yerleştirin ve bağlayıcı klipleri ile tutturmak mastik kurur (Şekil 2B-E). Mastik gecede kurumasını bekleyin. </li><li> Bağlayıcı klipleri, metal çubuk ve plastik ayırıcılar (Şekil 2F) çıkarın. Metal raylar üst kapalı mastik temizlemek için bir neşter bıçak kullanın. Microslide incelemek ve kabarcıklar, silikon baraj altındaki mevcut olduğundan emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Çıplak metal kuyuların içinde maruz kaldığı bu tür kuyuların oluşmuş olabilecek herhangi bir dolgu filmi çıkarın. Su ile doldurun ve bitişik iyi (ler) suyun içine sızıntı olmadığından emin olun. Tüm kuyuları için tekrarlayın. </li><li> Bitmiş microslide plastik tabak çanağı yan pencere (Şekil 2G) komşu metal direkleri ile uyar; elektrotlar sonunda metal direkleri eklenecektir. </li></ol> 2. DNA hazırlığı <ol><li> Plazmid DNA, buz üzerinde bir 1.5mL mikrosantrifüj tüp ekleyin ve saf su ile 150μl ses getirmek. Çoklu plazmid türlerin ortak elektroporasyon (örneğin, bir deney DsRed inşa ve kontrol GFP inşa) için kombine olabilir. Tüp DNA kısım son hacmi 60μl olacağını akılda tutmak için DNA miktarını hesaplarken. Tipik olarak, her yapı 0.5μg/μl son bir konsantrasyonda kullanılır. </li><li> 15μl 3M sodyum asetat (pH 5.2) ve 450μl% 100 etanol eklenerek DNA çöktürün. Karıştırmak için birkaç kez çevirin ya da tüp dokunun. </li><li> 4 DNA Spin ° C, 13.200 rpm, 30 dakika boyunca. Pelet% 70 etanol ile yıkayın, sonra tekrar 4 aşağı dönmeye ° C, 13.200 rpm, 15 dakika boyunca. Hava kuru pelet yarı şeffaf kadar, yaklaşık 7 dakika sonra 54μl steril su tekrar süspansiyon haline getirin. 6μl steril 10X PBS (pH 7.4) ve karışımı ekleyin. </li></ol> 3. Göz toplama <ol><li> Elektroporasyon odası ve% 70 etanol ile tüm aletleri sterilize edin. Göz toplama ve diseksiyon bir doku kültürü kaputu gerekmez iken, eldiven ve etanol ve steril koşullar işlem boyunca korumak için çalışır benchtop dezenfekte edin. </li><li> 3ml orta ve biri ile her iki 35mm yemekler: diseksiyon orta (: F12, 100U/ml penisilin, 100μg/ml streptomisin, 0.29mg/ml L-glutamin ve 5μg/ml insülin 01:01 DMEM oranı) ile Petri kapları hazırlayın 6ml orta ile 60mm çanak. Bu adım, bir doku kültürü kaputu yapılmalıdır. </li><li> Yeni doğmuş bir baş ve boyun (postnatal gün 0)% 70 etanol ile yavru fare dezenfekte edin. Makas ile hızlıca başını kesmek ve steril bir 100mm çanak baş aktarmak. </li><li> Gözleri ortaya çıkarmak için küçük makas ile kafa derisi kesilip. Kavisli bir forseps yavaşça yörüngesinin göz kaşık kullanın ve 35mm çanak diseksiyonu orta içeren bir göz. Bu düşük güçte bir diseksiyon mikroskobu altında gözleri kaldırmak için yararlı olabilir. </li><li> Tüm gözler toplanıncaya kadar 3.3 ve 3.4 adımları tekrarlayın. Diseksiyonu orta gözleri diseksiyon ise oda sıcaklığında tutun. DNA kısım başına 3-4 gözleri gerekecektir. </li></ol> 4. Retina diseksiyonu <ol><li> % 70 etanol, jilet ve steril bir plastik transfer pipetin wrapper dezenfekte etmek için kullanın. Bıçak ile pipet ucu kapalı bir bütün göz emmek böylece kesin. Pipet kullanılmadığı zaman plastik ambalajında ​​saklayın. </li><li> 60mm, 35mm çanak çanak bir göz aktarın. Yüksek güçte diseksiyon mikroskobu altında, göz yüzeyinde, ekstraoküler kas ve yağ olarak, herhangi bir doku kaldırmak için ince forseps kullanabilir. Daha sonra, optik sinir üssünde kapalı kısma çıkarın. </li><li> Retinanın izole etmek için, küçük bir delik prize ilimbus sklerasına n. Forseps iki çift uçlu bir delik (retina yüzeye teğet) yerleştirin ve hafifçe açmak sklera / RPE gözyaşı. Albino farelerde, sklera ve RPE retina dokusu, homojen mat gri renkte parlak akraba görünür. Pigmentli farelerde, RPE siyahtır. Objektif bir yerde bırakın. </li><li> Disseke retinanın orta ile diğer 35mm çanak içine taşımak için transfer pipet kullanın. </li><li> Tüm gözler disseke kadar 4.2 ve 4.4 için gerekli adımları tekrarlayın. </li><li> Electroporate için hazır olana kadar 37 ° C doku kültürü inkübatör retina saklayın. </li></ol> 5. Elektroporasyon için hazırlanması <ol><li> Orta 35mm yemekleri hazırlayın. Electroporated her DNA kısım için, diseksiyon orta bir çanağı ve kültür ortamı, bir çanak (diseksiyon orta artı% 10 FBS) ihtiyacınız olacak. Uygun yemekler Etiket. </li><li> P200 pipet ve steril 1X PBS elektroporasyon çanak odaları yıkamak için kullanın. Her odasına 60-100μl bir hacme sahiptir. Her iki meclisin de üç kez yıkayın. </li><li> DNA alikotları odaları doldurun. Herhangi bir kullanılmayan odaları 60μl 1X PBS ile dolu olmalıdır. Elektroporasyon çanak elektrotlar bağlayın. </li><li> Elektroporatör aşağıdaki ayarları kullanın: modu, AG, voltaj, 30V, darbe uzunluğu, 50 msn, bakliyat, 5 sayısı aralığı 950 msn; polarizasyon, tek kutuplu. </li></ol> 6. Elektroporasyon <ol><li> Ince forseps lens retina kavramak ve elektroporasyon odaları içine aktarmak için kullanın. Her odasına 3-4 fare retina (Şekil 3) kadar tutar. </li><li> Objektif, pozitif elektrot için metal çubuğu ile içiçedir retina sıraya forseps kullanın. Odasından bir sonraki DNA üzerinden devam önlemek için her transferinden sonra bir Kimwipe forseps temizleyin. </li><li> Tüm retina hizalanır sonra, Elektroporatör üzerinde &quot;Başlat&quot; tuşuna basın. Küçük kabarcıklar, negatif elektrot için bağlı metal çubuğu oluşturmalıdır. </li><li> Elektrotlar çıkarın ve kapatın Elektroporatör. </li><li> Forseps yavaşça odanın duvarları uzak retina taşımak için kullanın. </li><li> Diseksiyonu orta içeren 35mm yemekleri odalarından retina aktarmak için steril bir transferi pipet kullanın. </li><li> Her iki meclisin de steril 1X PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra steril su ile durulayın. % 70 etanol ile Sprey çanak. </li></ol> 7. Kültür için filtreler retina yerleştirilmesi <ol><li> Kültür ortamı içeren 35mm yemekleri retina aktarmak için bir transfer pipet kullanın. </li><li> Etiket ve steril 6-iyi bir kültür plaka kuyu 3ml kültür ortamı ile her iyi doldurun. </li><li> Orta tepesine kadar yuvarlak whatman Nuclepore filtreler, parlak tarafı, her iyi steril forseps kullanın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, filtre, lens tarafı aşağı üzerine retina aktarmak için steril bir transferi pipet kullanın. Retina toprakları objektif-yan-up, pipet ve tekrar yere girişimi ile pick up. 4 retina fazla bir filtre yerleştirin ve her bir retina çevresindeki orta damlacıkları diğer damlalarla ayrı kalacağından emin olun. Diğer protokolleri önce bu adımı 9 lens çıkarılması için çağrıda rağmen, bozulmamış lens ile kültür retina unutmayın. </li><li> 37 kültür plakasına yerleştirin ° C doku kültürü inkübatör (% 5 CO 2) ve zaman istenilen miktarda, genellikle sekiz gün için büyümek. Bir ortam değişikliği, uzun kültürü süreler için gerekli olabilir, ancak bizim deneyim, orta değişen sekiz günlük kültür döneminde gereksizdir. </li></ol> 8. Hasat ve floresan retina eksplantlar flatmounting <ol><li> % 4 paraformaldehid / 1X PBS ile her kuyuda kültür ortamı değiştirin. Retina, filtrelere takılıp kalırsa, filtre kapalı retina kabuğu hafifçe üzerindeki filtreler çevirmek için forseps kullanabilir ve. Için paraformaldehid de 30 dakika inkübe edin. oda sıcaklığında. Floresan beyazlatma önlemek için ışık retina koruyun. </li><li> Retina 1X PBS içinde 10 dakika boyunca iki kez durulayın. </li><li> Retina PBS küçük bir damla, bir cam slayt üzerine aktarmak için bir pipet kullanın. Electroporated yan böylece floresan bir diseksiyon mikroskobu altında (yani, objektif tarafı aşağı) retina çevirmek için forseps kullanabilir. </li><li> Yeri cam slayt köşeleri ezilmiş lamelleri (yaklaşık 1-2 mm çapında cam kırıkları) yapılan &quot;feet&quot;; bu ayaklar retinanın düzleştirme önlemek. Ayakları üzerinde retina ve dinlenmeleri kapsar ve böylece slayt üzerinde sağlam bir cam lamel yerleştirin. Gerekirse, slayt ve lamel arasında daha PBS eklemek için bir pipet kullanın. </li></ol> 9 - Görüntüleme ve flatmount floresans ölçümü <ol><li> Bir kullanın.floresan bileşik mikroskop, görüntü kırmızı ve yeşil kanalları düşük güç (4X objektif) flatmounted retinanın bir siyah-beyaz kamera ile donatılmıştır. Tüm retina floresan yoğunluklarına göre etkinleştirmek için, belirli bir floresan kanal için aynı pozlama süresi ile görüntülü olmalıdır. Herhangi bir resmi piksel doymuş, ya da başka bir doğru kantifikasyon imkansız olacaktır emin olun. İhracat görüntüleri TIFF formatında gri tonlama. </li><li> ImageJ yazılımı (retina (yani .., kırmızı kanalı ve yeşil kanal) görüntüyü açın <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). Bu yazının uğruna, yeşil flüoresan kanal (GFP protein), deney tüm retina üzerinde sabittir kontrol yapıdır. Kırmızı floresan kanal (DsRed protein), retina her set için değişir deneysel bir yapıdır. Gri tonlamalı görüntüler olmalıdır. </li><li> ImageJ, kontrol yeşil görüntüyü seçmek ve çapı 100 birim (Analiz / Araçlar / ROI yöneticisi / / belirtin) ile ilgi bir daire belirtin. Toplam sekiz çevreler oluşturmak için bu daire (ROI yöneticisi / Ekle) çoğaltın. Kaçınarak, retina ve lens (Şekil 4A) üzerinde bölgenin dış kenarları düzgün electroporated beş bölge seçmek için çevrelerde 1-5 taşıyın. Ayrıca, retina / eşiğe ölçmek için objektif üç bölge dışında (daireler 6-8) seçin. Kırmızı görüntü seçin, ROI yöneticisi kutusu &quot;Tümünü göster&quot; ve tekrar kontrol edin kutunun kontrol edin. Tüm sekiz daire kırmızı görüntü görünmelidir. De seçin tüm daire ROI yöneticisi koordine eder. </li><li> Ölçümleri 1-8, 1-5, kırmızı retina ölçümleri ve 6-8 kırmızı zemin ölçümleri görünmelidir; kırmızı bir görüntü seçildiğinde, (ROI yöneticisi / Tedbir) ilgi her daire için ortalama piksel değeri kaydetmek. Yeşil bir görüntü seçin ve ortalama piksel değeri kaydetmek; ölçümleri 9-16, 9-13, yeşil retina ölçümleri ve 14-16 yeşil arka plan ölçümleri görünmelidir. Excel&#39;e analizi için ölçüm verileri (Şekil 5) kopyalayın. </li><li> Ortalama üç kırmızı hem de arka plan ölçümleri ve yeşil kanallar. Kırmızı kanal beş retina ölçümlerin her kırmızı arka plan ortalama çıkarma, yeşil kanal için tekrarlayın. Her bir retina bölge çıkarları için, kontrol yeşil seviyesi (Şekil 5) deneysel kırmızı seviyesi normale döndürmek için, arka plan çıkarılır yeşil ölçümü ile arka plan çıkarılır kırmızı ölçüm bölün . </li><li> Belirli bir DsRed oluşturmak (örneğin, retina kez 3 ayrı retina başına 5 ölçüm) için normalize bütün ölçümlerin ortalama ve standart sapma belirleyin. Kantitatif farklı günlerde gerçekleştirilen electroporations sonuçları karşılaştırmak için, her zaman her elektroporasyon set bir &quot;standart&quot; DsRed / GFP yağış içerir. Bu ifade seviyesine normalize deneyler göreceli ifade değerleri mukayese edilebilir &quot;standart.&quot; </li></ol> 10 Temsilcisi Sonuçlar: Retina yüzeyinin 1 / 3 1 / 4 çapında DNA yapı (lar) (Şekil 4A) ifadesi iyi bir elektroporasyon sonuçları. Özellikle çubuk fotoreseptör verimli transduced olduğundan, bu tekniğin fotoreseptör spesifik promotor aktivitesi (Şekil 4B) ölçülmesi için idealdir. Daha önce özel çubuk Rho ve Gnat1 lokusların 10 organizatörü varyantlarının aralığını ölçmek için bu yaklaşımı kullanmıştır. Biz neredeyse 300 kat aralığı üzerinde promotor aktivitesi ölçmek mümkün olduğunu bulundu. Şekil 5, tek bir electroporated retinanın bir örnek veridir. Bu özel örnekte, deneysel inşa pNrl (1.1kb) DsRed kırmızı kanal ölçüldü ve kontrol inşa pNrl (3.2kb)-GFP yeşil kanal ölçüldü. PNrl için tam bir veri kümesi (1.1kb) DsRed bir yapı, bu şekilde ölçülen 6-9 retina oluşacak ve tüm değerleri &quot;GFP için normalize DsRed&quot; standart sapma göre hesaplanır olacaktır. PNrl ifade seviyesi (1.1kb) DsRed için karşılaştırarak olsaydı, örneğin, pNrl (0.8kb) DsRed, daha sonra her iki yapıları aynı GFP kontrolü (örneğin, pNrl (3.2kb) electroporated olması gerekir - GFP) ve görüntülü aynı pozlama süreleri. Bu, bir standart DsRed / GFP elektroporasyon (örneğin, pNrl (3.2kb) dsRed + pNrl (3.2kb)-GFP) her gün farklı günlerde toplanan havuzu veri mümkündür . Her deneysel bir yapı için, normalize DsRed seviyesi, daha sonra &quot;standart&quot; (pNrl (3.2kb) dsRed) normalize DsRed seviyesine normalize olacaktır. Biz burada açıklamak teknik fotoreseptör Cres 10,13 faaliyet ölçülmesi için özellikle yararlıdır.Hücre tipi özel cis-düzenleyici aktivite gibi bipolar hücreler 14 gibi nadir retinal hücre tiplerinde de sayılabilir veriler, ancak bu genellikle sayısal ilgi alanlarında flatmount hazırlıkları ziyade dikey kesitler seçilmiş olması gerekir. Aynı, fotoreseptör ve bipolar hücreleri gibi çok sayıda hücre tipleri ifade sürücü Cres doğrudur. Deneysel prosedürleri, aksi takdirde benzer. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 retina eksplant elektroporasyon prosedürü genel bakış. Öncelikle, tüm gözler postnatal gün 0 fare yavrular izole edilir ve retina (P1) disseke. İkincisi, retina, DNA ve electroporated (P2) ile dolu odalarına yerleştirilir. Üçüncü olarak, retina filtreler yerleştirilir ve sekiz gün (P3) kültüre. Dördüncüsü, retina eksplantlar, sabit kızaklar üzerinde monte edilmiş ve görüntülü vardır. Floresans şiddeti ImageJ yazılımı (P4) ile ölçülür. Beşincisi, ImageJ veriler çeşitli rehberleri (P5) faaliyet farkı ölçmek için bir elektronik tablo programı işlenir. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 elektroporasyon çanak yapımı. A) Harvard Apparatus, BTX modeli 453 (katalog # 45-0105) Değiştirilmemiş microslide odası. B) Bir Dremel aleti, plastik bir tüp raf kapalı kolu kesmek için kullanılır. : 0.8cm uzunluk, yükseklik 0.6cm, genişlik 0.3cm kolu aşağıdaki boyutları ile dikdörtgen ayırıcılar içine kesilir. C) plastik ayırıcılar, eşit aralıklarla microslide odasına donatılmıştır. Akvaryum mastik aralayıcılar (gösterilmemiştir) arasındaki boşluklar içine enjekte edilir. D) Bir metal çubuk ayırıcılar üzerine yerleştirilir. E) bar ve ayırıcılar gecede mastik kurur olarak her şeyi yerinde tutmak için bağlayıcı klipleri slayt üzerine kenetlenir. F) ayırıcılar kaldırılır ve kuyulardan su geçirmez olduğunu sağlamak için test edilmektedir. G) bitmiş slayt ile plastik tabak çanağı yan pencere komşu metal çubuklar içine sığar. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 retina ile elektroporasyon çanak diyagramı. Odaları DNA çözümleri (bir defada en fazla beş farklı çözümler) ile doldurulur. Beş odalarının her birinde üç ya da dört retina uyacak; retina odaları ve odaklı objektif, pozitif elektrot için metal çubuğu yaslanmış şekilde yerleştirilir. Negatif yüklü DNA molekülleri elektrik akımı retina hücreleri içine taşımak için neden olacaktır. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Flatmount retina floresan düzeyleri Şekil 4 A) ImageJ ölçüm. , Bu görüntüleri sadece bilgi amaçlıdır için renkli olduğuna dikkat edin; DsRed (deneysel) ve GFP (kontrol) kanalları ImageJ yazılım açıldı flatmount gri tonlamalı görüntüler. Beş ölçüm daireler (1 ile 5), kenarları ve lens (noktalı çizgiler) kaçınarak, düzgün electroporated bölgeler üzerinde yerleştirilir. Üç ölçüm çevreler (6 ile 8 arasındaki), arka plan floresan düzeylerini belirlemek için retina dışına yerleştirilmiş. B), yüksek güçte bir electroporated retina eksplant kesitsel görüntüler. Eksplant 4 gecede% 30 sucrose/1X PBS cryoprotected postnatal gün 8 ° C, OCT gömülü sabit ve 12μm az cryo-kesitli oldu. Floresan yapıları pNrl (1.1kb) DsRed ve pNrl (3.2kb)-GFP fotoreseptör hücrelerinin dış nükleer tabaka (onl) olarak ifade edilir. INL, iç nükleer tabaka; GCL, ganglion hücre tabakası. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5 Excel kullanarak floresan verilerin işlenmesi. 1. adımda, her bir ölçüm daire için ortalama piksel değeri tablo (hücre B3-B12, F3, F5, H3-H5) kopyalanır. Ölçümler # 1-5 DsRed retina değerleri ve 6-8 DsRed arka plan değerleri; ölçümleri # 9-13 GFP retina değerleri ve 14-16 GFP arka plan değerlerdir. Not ölçüm # 1 ve # 9 ölçümleri # 2 ve # 10 gibi, aynı ölçüm daireye karşılık gelir ve bu. 2. adımda, DsRed ve GFP kanallar için ortalama temel değeri (hücre F6, H6) hesaplanır. 3. adımda, her retina ölçüm ortalama arka plan çıkarılır (hücre C3-C12). 4. adımda, her DsRed ölçüm karşılık gelen GFP ölçümü (hücre D3-D7) normalize arka plan çıkarılır.

<ol>
	<li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design. , (2005).</li><li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genomic regulatory systems : development and evolution. , (2001).</li><li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; signals. , (2002).</li><li>Blow, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+identification+of+weakly+conserved+heart+enhancers.">ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers.</a> Nat Genet. 42, 806-810 (2010).</li><li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers.">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites.">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li><li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine.">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li><li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse.">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li><li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors.">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li><li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression.">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation.">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li></ol>

Eksplant elektroporasyon gelişmekte olan fare retinada cis düzenleyici aktivite nicel basit bir araçtır. Fare transgenesis ile cis-düzenleyici analizi ile karşılaştırıldığında, elektroporasyon, sadece yeni doğan fare yavrular, DNA, diseksiyon aletleri ve elektroporasyon / doku kültürü ekipmanları gerektiren, çok ucuzdur . Bu çok daha az zaman alıcı: bir deneyde, görüntüleme ve veri analizi için deney sonunda hazırlık süresi sadece birkaç saat, sekiz gün bir kültür dönemi, bir kaç saat gerektirir. Gerçek retina dokusunun kullanılmaktadır Eksplant elektroporasyon da hücre kültürü-tabanlı cis-düzenleyici analiz daha üstün. Retina eksplant oldukça normal olarak gelişir kültür-fotoreseptör dış segmentleri ayrıntılı başarısız olmasına rağmen, üç ayrı cep katmanları (dış nükleer tabaka, iç nükleer tabaka, ganglion hücre tabakası) oluşturur. Bir diğer avantajı da eksplant elektroporasyon yüksek tekrarlanabilir. Hatta farklı günlerde farklı retina içine electroporated aynı yapıları, aynı göreceli ekspresyon düzeyleri genellikle sonuç. Ayrıca, electroporated plazmid episomally çekirdeğinde muhafaza edilmesi düşünülen ve kromozomlar içine dahil olmadığı için, onlar transgenik farelerde yapılan cis düzenleyici analiz altüst aynı entegrasyon site etkileri tabi görünmez yapmak. Eksplant elektroporasyon çeşitli sınırlamalar var. İlk olarak, hücre döngüsü hala sadece hücreleri verimli elektroporasyon 15 transduced olabilir. P0, çubuklar ve daha sonra doğan diğer retina hücre tipleri (bipolar hücreleri, amacrine hücreler, K Müller glia), bu yöntemle hedeflenen ana hücre popülasyonlarının. P0 elektroporasyon koni fotoreseptörlerin Elektroporasyon 16 rapor ancak verimliliği düşük olduğu görülmektedir. Ikinci bir sınırlama ötesinde bu eksplant kültür retinanın ilerici malformasyon iki hafta sonuçları ve bu nedenle tavsiye edilmez. Bölüm 9 açıklandığı gibi organizatörü kantifikasyon geç timepoints gerekiyorsa, ancak, bir in vivo elektroporasyon 9 istenilen timepoint retina diseksiyon ile takip yapılabilir olabilir disseke retinanın düz montaj, ve ölçülmesi. Üçüncü bir sınırlama Bu testte sadece orta yüksek verimli olmasıdır. Yüz yapıları tek bir deneyde test hücre kültürü tabanlı testlerin aksine, bu protokolde tanımlanan teknikle inşa ortalama bir bütün fare retinanın en az gerektirir. Böylece, sadece bir kaç düzine yapıları makul bir günde electroporated olabilir. Bugünkü yaklaşım kullanarak promotor aktivitesinin ölçülmesi açısından ek bir ihtar, özellikle çok güçlü destekçileri assaying, GFP kanal içine DsRed floresan &#39;kanama&#39; bir potansiyel olduğunu. Bu nedenle emisyon spektrumu bu GFP kısmen örtüşmektedir DsRed. Bu sorunu aşmak için, optimum emisyon filtreleri DsRed ve GFP arasındaki spektral örtüşme en aza indirmek olmalıdır. Gibi optimize filtre setleri mevcut değildir, başka bir potansiyel çözüm GFP yerine bir mavi-kaymıştır floresan protein (örneğin, BFP veya CFP) kullanmak olacaktır .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Elektroporasyon çanak, Microslide 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Değişiklikler için protokol bölüm 1 </td></tr><tr><td> % 100 silikon kauçuk akvaryum çimento </td><td> Perfecto Üretim </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plastik mikrotüp raf </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Sadece rafa kolu olacak </td></tr><tr><td> Dremel aleti </td><td></td><td></td><td> Plastik tüp raf kapalı kolu kesmek için </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X konsantrasyonu </td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> 1000X hisse senedi için, 5mM HCl ve filtre sterilize 5mg/ml az tekrar süspansiyon </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Kare dalga Elektroporatör </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore filtreleri </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> Doku kültürü inkübatör </td><td></td><td></td><td> 37 ° C,% 5 CO 2 </td></tr><tr><td> Cam lamelleri # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> Kalın 0.16mm </td></tr><tr><td> Floresan bileşik mikroskop, kamera ile donatılmış </td><td></td><td></td><td> Kamera monokromatik (Hamamatsu örneğin, ORCA-ER kamera) olmalıdır . </td></tr><tr><td> EGFP / bileşik mikroskop için DsRed filtre seti </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 86007 </td><td> Bu filtre, kırmızı ve yeşil chanenels arasındaki en aza indirir bleedthrough </td></tr><tr><td> ImageJ Yazılım </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

Kısa cis-düzenleyici unsurlar (Cres) bağlanarak hücresel gen ağları içinde Transkripsiyon faktörleri Spatiotemporal desen ve hedef genlerin ifade düzeyleri kontrol upstream yalan, genomik DNA uzanır (~ 300-600 bp), alt ya da içinde kontrol eden genlerin intronlar. Cres (yani, arttırıcılar / yararlanıcı grup) genellikle 1-3 transkripsiyonel aktivatörleri ve repressörler için birden fazla kümelenmiş bağlanma yerleri oluşur. Transkripsiyonel giriş mantıksal entegratörleri spatiotemporally hassas ve kantitatif tam promotor aktivitesinin şeklinde üniter bir çıkış veren olarak hizmet vermektedir. Bugüne kadar cis-regülasyon memeli çalışmaların çoğu 4-5 Cres arttırıcı fonksiyonu assaying bir araç olarak fare transgenesis yararlanmıştır. Bu teknik, büyük ölçüde kantitatif olmayan, ekleme sitesi etkileri dikkate, zaman alıcı pahalı ve. Öte yandan, memeli CRE fonksiyonu için kantitatif testleri doku kültürü sistemleri (örneğin, çift lusiferaz deneyleri) geliştirilmiştir, ancak bu sonuçlar in vivo önemi sık sık belirsiz olmuştur. Elektroporasyon memeli doku yaşayan cis düzenleyici aktivite uzaysal ve kantitatif değerlendirme izin verdiğini geleneksel fare transgenesis için mükemmel bir alternatif sunuyor. Bu teknik, özellikle serebral korteks ve retina 6-8, özellikle merkezi sinir sistemi cis-regülasyon analizi yararlı olmuştur . In vivo ve ex vivo hem de fare retina elektroporasyon, gelişmiş ve yaygın Matsuda ve Cepko 6-7,9 tarafından açıklanan olsa da, son zamanlarda electroporated fare retina 10 fotoreseptör-özel Cres aktivitesini ölçmek için basit bir yaklaşım geliştirmiştir. Elektroporasyon retina içine tanıtıldı DNA miktarı deneyinin deney değişebilir göz önüne alındığında, tüm deneylerde bir co-electroporated yükleme kontrol &#39;dahil edilmesi gereklidir. Bu bağlamda, kültür hücreleri promotör aktivitesini ölçmek için kullanılan çift lusiferaz assay tekniği çok benzer. Fotoreseptör cis-düzenleyici faaliyet assaying, elektroporasyon genellikle zirve çubuk üretimi 11-12 zamanında doğmuş farelerin (postnatal gün 0, P0) yapılır. Bir kez retinal hücre tipleri post-mitotik haline elektroporasyon daha az verimlidir. P0 az electroporated hücrelerinin çoğunluğu göz önüne alındığında, yeni doğmuş farelerin ve çubuklar yetişkin fare retina hücrelerinin% 70 daha fazla sahip olmasına çubuk doğum oranının yüksek çubuklar. Bu nedenle, çubuk fotoreseptör elektroporasyon üzerinden çalışma kolay retinal hücre tipi. Biz burada açıklamak teknik fotoreseptör Cres faaliyet ölçülmesi için özellikle yararlıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation at JoVE.com

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Bu protokol ile fare retina eksplant elektroporasyon yaşayan cis-düzenleyici unsurlar (yani artırıcı / rehberleri) aktivitesini ölçmek için basit ve ucuz bir şekilde açıklamaktadır. DNA hazırlığı, retina diseksiyonu, elektroporasyon, retina eksplant kültür ve fiksasyonu sonrası analizi ve ölçülmesi açıklanmıştır.

Aktivitesi miktarının Cis</emEksplant Elektroporasyon Fare Retina> Düzenleme Elemanları

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

14.4K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. Bu protokol ile fare retina eksplant elektroporasyon yaşayan cis-düzenleyici unsurlar (yani artırıcı / rehberleri) aktivitesini ölçmek için basit ve ucuz bir şekilde açıklamaktadır. DNA hazırlığı, retina diseksiyonu, elektroporasyon, retina eksplant kültür ve fiksasyonu sonrası analizi ve ölçülmesi açıklanmıştır.

Video: Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

The rhombic lip is an embryonic neuroepithelium located in the hindbrain at the junction between the neural tube and the roofplate of the fourth ventricle (reviewed in 1). The rhombic lip can be subdivided into the upper rhombic lip (URL) which encompasses rhombomere 1 (r1) and generates neurons of the cerebellum and the lower rhombic lip (LRL) which gives rise to diverse neuronal brainstem lineages 2-4. LRL derivatives include the auditory neurons of the cochlear nuclei and those of the precerebellar nuclei that are involved in regulating balance and motor control 5-8. Neurogenesis from the LRL occurs over a large temporal window that encompasses embryonic days (E) 9.5-16.55, 9. Different neuronal lineages emerge from the LRL as postmitotic cells (or are born) during distinct developmental days during this neurogenic window. 
Electroporation of gene expression constructs can be used to manipulate gene expression in LRL progenitors and can potentially change the fate of the neurons produced from this region 10-12. Altering gene expression of LRL progenitors in the mouse via in utero electroporation has been highly successful for manipulating lineages born on embryonic day E12.5 or later 10, 12-14. In utero electroporations prior to E12.5 have been unsuccessful primarily due to the lethality associated with puncturing the fourth ventricle roofplate, a necessary step in delivering exogenous DNA that is electroporated into the LRL. However, many LRL derived lineages arise from the LRL earlier than E12.5 9. These earlier born lineages include the neurons that comprise the lateral reticular, external cuneate, and inferior olivary nuclei of the precerebellar system which function to connect inputs from the spinal cord and cortex to the cerebellum 5. In order to manipulate expression in the LRL of embryos younger than E12.5, we developed an in vitro system in which embryos are placed into culture following electroporation.
This study presents an efficient and effective method for manipulating the gene expression of LRL progenitors at E11.5. Embryos electroporated with green fluorescent protein (GFP) driven from the broadly active CAG promoter reproducibly expressed GFP after 24 hours of culture. A critical aspect of this assay is that gene expression is only altered because of the expression of the exogenous gene and not because of secondary effects that result from the electroporation and culturing techniques. It was determined that the endogenous gene expression patterns remain undisturbed in electroporated and cultured embryos. This assay can be utilized to alter the fate of cells emerging from the LRL of embryos younger than E12.5 through the introduction of plasmids for overexpression or knock down (through RNAi) of different pro-neural transcription factors.

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

This study describes the development of an in vitro electroporation technique that allows for the manipulation of gene expression in the lower rhombic lip of midgestation embryos.

Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında

The rhombic lip is an embryonic neuroepithelium located in the hindbrain at the junction between the neural tube and the roofplate of the fourth ventricle ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Aktivitesi miktarının Cis Düzenleme Elemanları