Biz fakülte, arkadaşlarının, sakinleri, Brigham ve Kadın Hastanesi doktor ve yardımcıları, bu çalışmalar için doku kullanılabilir hale Patoloji Anabilim Dalı teşekkür ederim. Bu çalışma NIH / Ulusal Kanser Enstitüsü (P50 CA105009, K08 CA108748, u01 CA152990), Yumurtalık Kanseri Araştırma Fonu, araştırma hibeleri ile desteklenen Kay Vakfı, Novartis İlaç, Robert ve Deborah İlk Fonu, Randi ve Joel Cutler Yumurtalık Kanseri Araştırma Fonu, Marsha Rivkin Vakfı - Bilimsel Scholar Ödülü, AACR - George ve Kanser Genetiği Araştırma Patricia Sehl Bursu ve İsrail Tıp için Amerikan Doktor Kardeşliği - Claire ve Emmanuel G. Rosenblatt Vakfı Hibe.

1. Kollajen hazırlanması ve Filtre Kaplama. <ol><li> Human plasental kollajen hazırlamak için 30 mg, human plasental kollajen Tweeze ve heyecan bar ile 500 ml beher 50 ml distile su (dH 2 O) üst üste koymak. </li><li> Daha kolay çözülür hale getirmek için doğrudan kollajen üzerine 100 μls buzul asetik asit ekleyin. Sıcak - 37 ° C ve kollajen erimesi için karıştırın. 20-30 dakika içinde çözülür. Kolajen iplikçikleri çözüm kalırsa, filtre sterilizasyonu zor olacaktır. </li><li> DH 2 O ve 0,2 mikron membran filtre ile sterilize 450 ml, 50 ml stok sulandırınız. Bu son çalışma çözümdür. 4 ° C saklayınız </li><li> Transwell filtre membranlar kolajen (50-100 ul) gece boyu kaplama onları hazırlayın. Soğuk kollajen RT ısındı ve daha sonra bir gecede ve RT membran kapsayacak şekilde üst bölmesi eklenmesi gerekir. Ayrışmış primer fallop tüpü (FT) epitel (aşağıya bakın) transwell filtreleri üzerine kaplama önce üç kez 1X fosfat Aşırı kollajen kaldırmak için kullanmadan önce tuzlu su (PBS) en az 1 saat tamponlu filtreler yıkayın. </li></ol> 2. Doku Toplama ve Ayrılma. <ol><li> Taze fallop tüpü (FT) fimbria 50 ml santrifüj tüpüne steril 1X PBS içinde toplanır ve steril doku kültürü kaputu işleme istemi için önce buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır. </li><li> (Örnek toplanan veya başka bir medya türü en azından mümkün olduğu kadar çok kan ve yabancı medya olarak bu kaplama verimliliği ile etkileşebilir kurtulmak için 3X kanlı yıkama varsa) bir kez 20 ml soğutulmuş 1X PBS doku örneği yıkayın. </li><li> Steril neşter ve steril bir cımbız kullanarak, küçük bir PBS ve 10 cm doku kültürü çanak, steril bir cımbız transferi FT kullanarak, epitel hücrelerinin maruz kalma en üst düzeye çıkarmak için uzunlamasına kesilir. Artık bir tüp değil, neredeyse düz bir levha doku böylece fimbria açın. Sonra daha küçük ama daha hala geri adet (yaklaşık 3 mm çapında) oyulmuş. </li><li> 45 ml (1.4 mg / ml Pronase ve 0.1 mg / ml DNAz içeren MEM) 50 ml&#39;lik bir tüp içinde soğutulmuş disosiasyon medya adet aktarın. </li><li> 4 ° C 24 ila 72 saat için hafifçe sallayın. (48 saat deneyimlerinden, en uygunudur). Bir slaytta disosiasyon medya bir damla koymak, disosiasyon miktarını kontrol edin ve topaklanma ve doku canlılığı (tüycüklü hücreleri yenerek) miktarını kontrol etmek için. Tek hücreler ve bazı küçük öbekler hem de görmek istiyorum. </li></ol> 3. Fallop Tüp Kaplama. <ol><li> Epitel hücre ayrılma miktarı optimum olduğunda, FBS% 10 hacmi ekleyerek medya inaktive. Küçük agrega içine hücre süspansiyonu çıkarmak için birkaç kez ters çevirin. </li><li> Büyük doku kümeleri (stromal doku) alt tüp yerleşmek için izin verin. İkinci bir 50 ml&#39;lik tüp içine epitel hücreleri içeren ortamları çıkarın. </li><li> Orijinal 50 ml tüp 50 ml soğuk MEM (FBS) ekleyin. Ek hücreleri toplamak için ters çevirin. Üçüncü bir 50 ml tüp (örnek çok büyük ve yüksek hücre sayısı beklenen ise, bu adımı hücre toplama maksimize etmek için tekrar edilebilir) içine medya toplayın. Stromal / ekstraselüler doku büyük parça şimdi iptal edilebilir. Artık iki hücre süspansiyonu 50 ml tüpler var. Hücre pelletleri 5 dakika aspirat disosiasyon medya için 1000 rpm&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar ısındı USG medya (DMEM:% 2 USG ve% 1 Kalem Strep ile desteklenmiş F12) yaklaşık 5-10 ml içinde süspanse edin Yavaşça Pipet. Bu epitel hücrelerinde hasar ve kültürlerin kalitesini azaltabilir gibi çok güçlü bir şekilde pipetle için dikkatli olun. Tek hücre ve küçük öbekler (Şekil 1) olmalıdır. </li><li> En az 1 saat veya 3 saat kadar primaria kültür yemekleri ve inkübe üzerine aktarın. Fibroblastlar ve kırmızı kan hücreleri, plastik sopa ama FT epitel hücreleri olmaz. Plakasına şey yapışmasını olup olmadığını görmek için bir saat sonra bir göz atın. Siliyalı hücrelerinin varlığı kirpikler dayak belirterek tarafından görülebilir. </li><li> Bu İnkübasyon sırasında, kollajen kaplı filtreler (adım 1.4 &#39;e bakınız) yıkanmış ve hücre kaplama için hazır. </li><li> Primaria plakaları inkübasyon süresi 1-3 saat sonra, 15 ml tüp hücre süspansiyonu transferi ve durulama 5 ml USG medya ile primaria plaka, 15 ml nihai hacmi oluşturmak için bu medya tüp transferi. 1000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Dikkatlice aspire medya ve hücre pelletini bozmamak. Pelet boyutu tarafından bakılırsa, USG medya uygun miktarda tekrar süspansiyon haline getirin. Eğer gerekiyorsa daha sulandırmak böylece (Genellikle 1-3 ml arasında) Eksi başında daha iyidir. Yavaşça tekrar </li><li> Bir hemasitometre 10 ul yeniden süspanse hücre ve hücre yoğunluğu belirlemek. İpuçları: belirgin bir karanlık hücre zarı ve non-kolumnar epitel hücreleri arıyoruz. Ayrıca kesinlikle hareket tüycüklü hücreleri saymak. Halo appearan daha küçük hücrelerce, kırmızı kan hücreleri ve sayılmamalıdır. Orada bazı topaklanma, böylece hücre sayısı tahmin etmek gerekir. Tohumlama hedef 1,65 x10 5 hücre / membran, ya da en azından% 75 oranında filtre kapsama alanı (Şekil 1 ). Hücreleri çok seyrek kaplama varsa, hücreler tam bir epitel tabakası oluşturmak mümkün olmayacaktır. </li><li> USG medya ul 500 24 plaka iyi alt ve transwell eklemek. FT hücre süspansiyonu (yukarıya bakınız) gerekli olan hacim sonra her membran üzerine eklenebilir, bu genellikle 100 ul. </li><li> Inkübasyon ve membran rahatsız üst olmadan 1-2 gün büyümeye. Gerekirse bu gün boyunca bazal tarafında medya değiştirebilirsiniz. 1-2 gün sonra, USG medya ile üst dikkatlice yıkayın ve medya membran üstüne küçük bir miktar (50-100 ul). Bu medya, mikroskobu önce filtreler apikal tarafında kaldırılırsa, hücre kültürlerinin birleştiği belirlemek için daha kolaydır. Alt bölmesi, her zaman medya içermelidir. Bir kez kültürler tam konfluent (normalde 5 gün içinde), apikal taraf için bazal filtreler aracılığıyla yolculuk medya miktarı ihmal edilebilir olmalıdır. </li><li> Ilk 10 gün boyunca her iki günde bir kez bazal medya değiştirin. Alt bölmesi, her zaman hücrenin hayatta tutmak için medya sahip olması gerekir. Immünofloresan (IF) veya immünhistokimyasal (İHK) gibi daha ileri çalışmalar, kullanılabilir sıkı bir epitel tabakası (Şekil 1 ve 2) hücreleri oluşturdular. </li></ol> 4. Membran İşleme. <ol><li> Membran işlem yapılacaktır çalışmanın türüne bağlıdır, ancak genellikle transwell ekler filtre ayrılmasını gerektirir. </li><li> Bu filtreler genellikle 1X PBS 200 ul çıkarmadan önce 3 kez yıkanır. </li><li> Filtrelerin apikal ve bazal tarafındaki PBS aspire. Bu membranlar kurumasını önlemek için bir kerede 1 yapılmalıdır. </li><li> Plaka eklemek çıkarın, ters çevirin ve membran etrafında kesmek için steril bir neşter kullanabilirsiniz. Tek parça membran yerine kenarında neşter sürükleyerek membran kenarı etrafında düz kesimler yaparak kaldırmayı deneyin. </li><li> Parça hücrelerin hangi tarafta, tutarak, ekleme filtreyi kaldırmak için cımbız kullanın. Filtre, sonra uygun şekilde VARSA, İHK, vb işlenebilir. </li><li> Örnek: çalışmaları, filtre (uygun antikorlar ile fiksasyon, permeabilization, engelleme ve inkübasyon sonra, standart prosedürler EĞER göre) bir slaytta yer olmalıdır EĞER DAPI, Vectashield UP karşı karşıya hücrelerin filtre üzerine bırakılır ve bir kapalı cam lamel. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Transwell filtreleri kolayca immünhistokimyasal (İHK) ve immünofloresan (IF), hem de ex vivo epiteli incelemek için silinebilir. Spesifik belirteçler soyundan kullanarak, bir resim ve sekretuar (Pax8 pozitif) ve siliyalı bu kültürlerin (Sall2 pozitif) hücre bölme (Şekil 3) ölçmek. Ayrıca, bu belirteçler kullanarak, her bir hücre tipi, 10 farklı fizyolojik ipuçları nasıl tepki vereceğini izleyebilirsiniz. Bu sistem, çeşitli uyaranlara yanıt olarak, FT epitelin secretome ve hücre içi phosphoproteome değişiklikleri karakterize etmek için kullanılmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. İllüstrasyon, birincil insan fallop tüpü dokusundan üretilen nasıl ex vivo kültürler resmeden Fallop tüpü fimbrial doku cerrahi seti elde edilen ve 24-72 saat 2 disosiasyon medya ile yıkanır ve inkübe küçük parçalar 1 oluşturmak için kıyılmış . Disosiasyon tamamlandıktan sonra, doku parçalarının 3 hasat kuluçka tüpün alt ve ayrışmış epitel hücreleri içeren medya yerleşmek için izin verilir. Disosiasyon, verimlilik, faz kontrast mikroskop 4 altında incelenmesi ile izlenebilir . Ayrışmış epitel hücreleri daha sonra primaria plakaları kültüre fibroblast ve değişmez epitel hücreleri 5 Karıştım hematopoetik hücreler kaldırmanıza yardımcı . Olmayan epitel hücreleri yeterince kaldırıldıktan sonra, epitel hücreleri transwell human plasental kollajen 5 ile kaplı filtreler üzerine numaralı seribaşı. Medya alttan transwell aracılığıyla difüzyon ile sağlanır. Kültürler 24-48 saat inkübe edilir ve daha sonra apikal medya kaldırılır. Ex vivo kültürleri sonra transwell filtreler oluşturmak için 5-8 gün için tam, tam çim büyümeye izin verilir. 4 hafta kadar ex vivo kültürleri bu durumda viably korunabilir. Karikatür 5 hemato ekleme ve vitray kaldırılır bir filtre bir örneği ile tam olarak yetiştirilen ex vivo kültür gösterirxylin ve eosin (H &amp; E) ex vivo epitelin polarite ve mimari göstermek için. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. FT ex vivo kültürlerin Parlak alan mikroskobu transwell ekler human plasental kollajen 0.4μm gözenekleri ile kaplı (a) görünür. FT epitel hücreleri (c) bir epitel tabakası oluşturan kollajen kaplı ekler (b), kültür. Bazı enkaz normalde tüycüklü hücreleri en sık epitel kültür hücreleri (oklarla gösterilen) bağlı kalarak görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. FT ex vivo kültür immünofloresan (IF). Ex vivo kültürleri görüntülerini sabit ve (a) salgı (Pax8) karşı antikorlar ile boyandı ve (d) siliyalı hücre (Sall2) işaretleyicileri EĞER. DAPI hücre çekirdeğinin konumunu (mavi) (b) ve (e) ve birleştirilmiş antikor ve DAPI boyama da gösterilmiştir (c ve f) için bir kontrol olarak kullanılır. Sayıda hücre kültür hücreleri (Sall2 boyama, 3 gün Pax8 boyama, 7 gün) zaman uzunluğuna bağlıdır.

<ol>
	<li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J., Ward, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li><li>Markman, M., Walker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+chemotherapy+of+ovarian+cancer:+a+review,+with+a+focus+on+practical+aspects+of+treatment.">Intraperitoneal chemotherapy of ovarian cancer: a review, with a focus on practical aspects of treatment.</a> J. Clin. Oncol. 24, 988-994 (2006).</li><li>Liu, J., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+ovarian+cancer.">New advances in ovarian cancer.</a> Oncology (Williston Park). 24, 721-728 (2010).</li><li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary.">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li><li>Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancer:+a+proposed+unifying+theory.">The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory.</a> Am. J. Surg. Pathol. 34, 433-443 (2010).</li><li>Fong, M. Y., Kakar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+mouse+models:+a+summary+of+current+models+and+their+limitations.">Ovarian cancer mouse models: a summary of current models and their limitations.</a> J Ovarian Res. 2, 12-12 (2009).</li><li>Shan, W., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer:+focus+on+genetics+and+animal+models.">Epithelial ovarian cancer: focus on genetics and animal models.</a> Cell Cycle. 8, 731-735 (2009).</li><li>Levanon, K., Crum, C. P., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+pathogenesis+of+serous+ovarian+cancer+and+its+clinical+impact.">New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact.</a> J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).</li><li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+pathogenesis:+a+model+in+evolution.">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, 932371-932371 (2010).</li><li>Levanon, K., Ng, V., Piao, H. Y., Zhang, Y., Chang, M. C., Roh, M. H., Kindelberger, D. W., Hirsch, M. S., Crum, C. P., Marto, J. A., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ex+vivo+cultures+of+human+fallopian+tube+epithelium+as+a+model+for+serous+ovarian+carcinogenesis.">Primary ex vivo cultures of human fallopian tube epithelium as a model for serous ovarian carcinogenesis.</a> Oncogene. 25, 1103-1113 (2010).</li><li>Landen, C. N., Birrer, M. J., Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+the+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancer.">Early events in the pathogenesis of epithelial ovarian cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26, 995-1005 (2008).</li><li>Vermeer, P. D., Einwalter, L. A., Moninger, T. O., Rokhlina, T., Kern, J. A., Zabner, J., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+receptor+and+ligand+regulates+activation+of+epithelial+growth+factor+receptor.">Segregation of receptor and ligand regulates activation of epithelial growth factor receptor.</a> Nature. 422, 322-326 (2003).</li></ol>

Dr Drapkin Novartis İlaç için bir danışman. Diğer yazarlar ilgi herhangi bir potansiyel çatışmalar beyan ederim.

FT belirlenmesi SOC için kökenli aday bir site olarak bilinen risk faktörleri ve gerçek seröz kanserojen süreci birbirine bağlayan mekanizmaları deşifre yönelik temel ve translasyonel araştırma için fırsat sağlar. Kritik bu çözülebilir bir model sistemler bize FTSEC pelvik seröz karsinomlarda hücre kökenli olduğu hipotezini test başlamanızı sağlayacak bir gelişmedir. Burada açıklanan ex vivo kültür modeli yerli FT epitel morfoloji ve biyoloji koruyan bir şekilde birincil FT salgı ve siliyalı hücreler izolasyon ve co-kültür izin veren bir roman sistemidir. Bu sistemi kullanarak, son zamanlarda bu epitelin secretome karakterize ve nasıl epiteli mekanik ve genotoksik yaralanma 10 yanıt. Yumurtlama, yumurtalık tümörogenez ile ilgili önemli bir risk faktörü, doku hasarı, mediyatörlerin, büyüme faktörleri ve hormonlar 11 bir kombinasyonu ile karakterizedir. Bu sistem, salgı ve siliyalı hücreler tepki ve canlılığını ovulatuar bir ortamın etkisini araştırmak için kullanılabilir. Sürücü tipi hücre farklılaşması ve bu hücrelerin neoplastik dönüşüme katkıda bulunan faktörlerin yanı sıra, diğer hücre tipleri (yani inflamatuar hücreler) etkisi, olayların daha iyi anlaşılmasına izin incelenebilir. Benzer modeller polarize epitel mevcut olduğu diğer dokularda da tarif edilmiştir. Örneğin, epitel polarize primer kültürlerinde, hücre büyümesi ve hücre hasarına yanıt heregulin etkisi 12 değerlendirildi. Model sistemler bu tür yeni ve yararlı bir şekilde başlatılması ve epitel dokuların kaynaklanan tümörlerin patogenezi çalışma sağlamak ve bu dokularda hücre hatları var FT gibi kritik öneme sahip, ve büyük bir yerde var. anahtar yollarının belirlenmesi ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için gerekli.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>15-090-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultroser G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Chemical Company</td>
<td>67042</td>
<td>Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Primaria culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 well Transwell Permeable supports</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning (Costar)</td>
<td>3470</td>
<td> Clear, 6.5 mm insert, 0.4 &mu;m pore size, treated polyester </td>
</tr>
<tr>
<td>MEM (Minimal Essential Media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11459643001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sall2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr T. Benjamin, Harvard</td>
<td>Gift</td>
<td>1:20 dilution</td>
</tr>
<tr>
<td>Pax8 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proteintech</td>
<td>10336-1-AP</td>
<td>1: 1000 dilution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells

Epitelyal over kanseri, Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde kadın kanser ölümlerinin önde gelen nedenidir. Diğer kadınlara özgü kanserlerin aksine, meme ve rahim karsinom, ölüm oranlarının son yıllarda düşmüş gibi, yumurtalık kanseri kür oranları, son iki yıldır 1 üzerinde nispeten değişmeden kalmıştır . Bu ameliyat ve kemoterapi, 3, 2 en etkili erken evre hastalık tespiti için uygun tarama araçları eksikliği büyük ölçüde . Sonuç olarak, hastaların çoğu ileri evre hastalık ve karın bölgesine yayılmış katılımı ile mevcut. Bu, yumurtalık kanseri çok sayıda histolojik alt 4, 5 ile heterojen bir hastalık olduğu gerçeğini daha karmaşıktır. Seröz over kanseri (SOC), en sık görülen ve agresif tür ve en sık BRCA genleri mutasyonları ile ilişkili form . Bu alandaki deneysel modeller başlatan genetik olaylar ve 6, 7 hastalığı patogenezinde daha iyi anlamak için, kanser hücre hatları ve fare modelleri kullanımı dahil. Son zamanlarda, fallop tüplerinde, 8, 9 kökenli önerilen hücre olarak fallop tüpü (FT) salgı epitel hücresi (FTSEC), SOC kökeni için yeni bir site olarak ortaya çıkmıştır . Henüz hiçbir hücre hatları veya FT epitel veya FTSEC çalışma kültürü sistemleri vardır. Burada birincil insan FT epitel hücreleri, mimarisi, polarizasyon, immünfenotip ve fizyolojik ve genotoksik streslerinin yanıt koruyan bir şekilde kültüre bir roman ex vivo kültür sistemi açıklanmaktadır . Bu ex vivo modeli SOC çalışma için bu doku tümörleri ortaya nasıl daha iyi bir anlayış sağlayan, kullanışlı bir araç sağlar ve mekanizmaları tümör başlangıcında ve ilerlemesinde yer.

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Fallop tüpü (FT), seröz over kanseri (SOC) kökenli bir alternatif site olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol izolasyon için yeni bir yöntem açıklanır ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fallop tüpü epitel hücreleri kültür. Bu sistem özetlediği<em&gt; In vivo</em&gt; Epitel ve SOC patogenezinde çalışma sağlar.

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

ex-vivo-culture-of-primary-human-fallopian-tube-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

19.5K Görüntüleme.  Dana-Farber Cancer Institute. Fallop tüpü (FT), seröz over kanseri (SOC) kökenli bir alternatif site olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol izolasyon için yeni bir yöntem açıklanır ve Ex vivo Fallop tüpü epitel hücreleri kültür. Bu sistem özetlediği In vivo Epitel ve SOC patogenezinde çalışma sağlar.

Video: Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...