Questo lavoro è stato supportato dal US National Science Foundation sovvenzioni # 0741914 e-MCB MCB-0843627; ulteriore supporto infrastrutturale è stato fornito presso il City College di New York dal National Institutes of Health RR03060 2 G12-26 dal Centro Risorse Nazionale per la ricerca. Riconosciamo con gratitudine il JKC Rosa gruppo nel Dipartimento di Biologia Cornell University impianto per la fornitura di M82 (wild type) e CM15 (mutante) cuticole pomodoro. Ringraziamo il dottor Spyros Monastiriotis dal gruppo CCNY Ingegneria Chimica del Prof. Alexander Couzis per il suo aiuto generoso con gli esperimenti AFM. Ringraziamo la signora Lauren Gohara per il supporto progettazione grafica.

1. Isolamento enzimatica di pomodoro cuticole 5 <ol><li> Mettete i pomodori più commerciali o coltivata in una ciotola. Sbucciare la pelle dai frutti nelle sezioni di grandi dimensioni; eliminare il tessuto interno pericarpo. Lavare le bucce di pomodoro con acqua deionizzata e mantenere sotto acqua in un becher. </li><li> Preparare una 50 mM pH 4,0 tampone acetato di sodio (a 31 ° C) mettendo 1,22 g di sodio acetato triidrato (M r. 136,08 g / mol) e 2,34 ml di acido acetico glaciale (17,485 M) in un becher, aggiungendo 200 ml di acqua deionizzata, e quindi regolando il pH di 4,0 a 31 ° C. Preparare una miscela contenente 4 ml di pectinasi (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI America), 0,2 g di cellulasi (CE 232.734.4; 1,3 unità / mg di solido, Sigma Aldrich), 13 mg e NaN 3, e quindi aggiungere 196 ml di tampone sodio acetato alla miscela di enzima per ottenere 200 ml di cocktail enzimatico finale. 5 immergere completamente la pelle pelati in cocktail enzima e incubarea 31 ° C per 24 ore con agitazione costante (G24 ambientale agitatore incubatore; New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Raccogliere le bucce di pomodoro con un colino da cucina o imbuto Büchner e lavarli con acqua deionizzata. Successivamente, metterli in un forno sotto vuoto a temperatura ambiente per un&#39;ora. Mantieni le bucce di pomodoro secchi in una bottiglia etichettata e limitato per le procedure di deceratura successive. </li></ol> 2. Deceratura esaustivo per estrazione Soxhlet 6 <ol><li> L&#39;attrezzatura utilizzata per la deceratura esaustivo consiste in una sorgente di calore (riscaldamento mantello e Variac controller), pallone a fondo tondo per un serbatoio del solvente, Soxhlet, vetro sinterizzato ditale o ditale monouso, anti-ebollizione chip e un condensatore (vedi fig. 1). Si noti che il braccio sifone stretta (parti 6 e 7 in Fig. 1) è molto delicato e soggetto a rottura, richiedono un accurato trattamento. </li><li> Mettere 0,5-1 g di pelle di pomodoro (ottenuto infase 1.) in un mortaio, e macinare il campione di una polvere grossolana con un pestello meno che i campioni devono essere utilizzato per misurazioni AFM (punto 5). Riempire un ditale vetro sinterizzato o monouso approssimativamente a metà con il campione e utilizzare una pinzetta per posizionare accuratamente alla base della colonna di estrazione. </li><li> Collegare il condensatore e avvolgerlo con un foglio di alluminio. Riscaldare il metanolo solvente (ACS grado) in presenza di qualche anti-ebollizione chip fino ad ebollizione dolcemente e riflussi sulle pareti del pallone. Coprire il serbatoio del solvente sia con lana di vetro e foglio di alluminio. Controllare il processo per un&#39;ora, regolando la tensione Variac in modo che il serbatoio si accumula su una goccia al secondo sifone e si verifica all&#39;interno di Soxhlet quando il tamburo è pieno. </li><li> Continuare il processo di estrazione per 12 h, quindi abbassare il mantello di riscaldamento e consentire l&#39;apparecchio si raffreddi. Rimuovere l&#39;estrattore e il serbatoio come una singola unità di disporre del solvente. Utilizzare tweezers per sollevare il ditale a appena sotto il collo della colonna di estrazione, drenare l&#39;eccesso di solvente da esso, e posizionare il tamburo su una superficie pulita. Inclinare la colonna di estrazione per consentire sifone nel pallone sottostante. Togliere il pallone e versare i rifiuti in un contenitore per rifiuti debitamente etichettato solvente. </li><li> Ripetere le fasi 2.3 e 2.4 per le successive solventi di polarità progressivamente decrescente, ad esempio, cloroformio ed esano per 12 h in ciascun caso. </li><li> Lasciare il campione cutina pomodoro per asciugare all&#39;interno del ditale, o soffiando un flusso di gas azoto sopra o ponendolo in un forno sotto vuoto a temperatura ambiente. Infine, misurare la massa del campione secco e conservare a temperatura ambiente in un tappo a vite vaso sigillato con parafilm. </li></ol> 3. Isolamento selettivo delle Cere Epicuticular e intracuticolare 3,4 <ol><li> In primo luogo, lavare i pomodori interi (un lotto separato di pomodori da quelli descritti al punto 1.) Con acqua distillata. Asciugare con paper asciugamani e Kimwipes, e metterli staminali verso il basso su un pezzo di foglio di alluminio. </li><li> Dipingi i pomodori interi con il 120% (w / w, rapporto di massa), la gomma arabica soluzione acquosa in un top-down e consentire di moda circa un&#39;ora per la gomma arabica ad asciugare sulla pelle del frutto, lasciando una sottile pellicola. Rimuovere la pellicola con una pinzetta, facendo attenzione a non forare la pelle di pomodoro. Ripetere la procedura una seconda volta. </li><li> Aggiungere i film di fiale contenenti 1:1 (v / v) cloroformio-acqua e agitare per tre minuti. Dopo agitazione vigorosa e separazione di fase, pipettare le frazioni di cloroformio e far evaporare in distinte fiale scoperti, lasciando cera epicuticular. I pomodori rimarranno fisicamente integra. Passarle in cloroformio per due minuti a temperatura ambiente e raccogliere la cera intracuticolare dopo evaporazione del solvente. Ora, buccia i pomodori e trattarli enzimaticamente (con cellulasi e pectinasi in tampone sodio acetato) per rimuovere cellulosa e pectina, rispettivamente (come descritto nella <strong&gt; 1). </li><li> Se desiderato, eseguire deceratura esaustiva di tali cuticole enzimaticamente isolate mediante estrazione Soxhlet (vedi punto 2), utilizzando tre solventi di polarità diversa (metanolo, cloroformio, esano e, rispettivamente). </li></ol> 4. Caratterizzazione molecolare di cutina Tomato Fruit dal Cross-polarizzazione Magic-angolo di Spinning a stato solido Risonanza Magnetica Nucleare (CPMAS ssNMR) 6 <ol><li> Luogo 4-6 mg di cuticole pomodoro pienamente deparaffinati (cutins) in un mm 1.6 fastMAS zirconia rotore utilizzando il tool fornito dal produttore di imballaggio. (Sia le cuticole pomodoro terra deparaffinati o pezzi molto piccoli di cuticole parzialmente deparaffinati sono adatti.) Accertarsi che il campione è imballato in modo uniforme, ma non troppo stretto, nel rotore. Dopo aver messo sul tappo superiore, dipingere mezzo del tappo con un inchiostro nero pennarello per facilitare le misure della velocità di rotazione. </li><li> Regolare la shimming dello spettrometro NMR per la larghezza minima riga spettrale a metà altezza unond calibrare il protone (1 H) e carbonio (13 C) 90 ° larghezza di impulso con un composto standard come adamantano. </li><li> Utilizzo di glicina o glutammina come composti modello, ottenere massima intensità del segnale ottimizzando tutti i parametri (Hartmann-Hahn corrispondenti livelli di potenza, 1 H - 13 C tempo di contatto, eteronucleari 1 H resistenza disaccoppiamento) delle cross-polarizzazione magic-angle spinning (CPMAS) esperimento. Per spettri acquisito a una frequenza di 1 H 600 MHz, condizioni raccomandate comprendono 10 kHz o 15 kHz frequenza di filatura, una 3-sec ritardo tra acquisizioni, e spinale protone eteronucleari disaccoppiamento 7 ad una intensità di campo magnetico equivalente a una frequenza di 185 kHz. </li><li> Inserire il cutina ricco di rotore nella sonda. Quindi, posizionare la sonda nel magnete. Aumentare la velocità di rotazione fino a 10 kHz a poco a poco per verificare imballaggio buon esempio e la stabilità del rotore. Verificare la stabilità di filatura finale del rotore entro± 20 Hz. </li><li> Regolare la sintonizzazione e corrispondenti condensatori della sonda iterativo per ottenere la riflessione minimo di energia sia 1 H e 13 C NMR frequenze. Impostare la temperatura sperimentale a 25 ° C (o temperatura ambiente). </li><li> Avviare il pre-ottimizzato esperimento CPMAS corrispondente alla Hartmann-Hahn determinata condizione di corrispondenza con la frequenza 10 kHz filatura. </li><li> Acquisire 4096 transitori, condizione dello spettro con esponenziale (Lorentzian) linea ampliamento di 50-100 Hz, e fare una trasformata di Fourier per generare uno spettro NMR di intensità del segnale vs chimica schermatura (ppm). </li><li> Fare riferimento alla chimica C 13 turni esternamente usando set adamantano a 38,4 ppm (-CH 2 - gruppo) 8 come standard. </li><li> Aumentare la frequenza del rotore di filatura a 15 kHz e ripetere la misurazione CPMAS (passi 4.6-4.8) corrispondente alla Hartmann-Hahn condizione di corrispondenza determinata in questa frequenza quest&#39;ultimo filatura. </li><li> REPEagli esperimenti CPMAS (passi 4.1-4.9) con i campioni di frutta naturali (ceroso) e parzialmente decerati cuticola. </li></ol> 5. Sondaggio della superficie della cuticola di pomodoro con microscopia a forza atomica (Digital Instruments Nanoscope IIIa, le procedure possono variare leggermente tra i microscopi) 6 <ol><li> Accendere il microscopio a scansione di sonda (SPM) (Fig. 2) e assicurarsi che il selettore di modalità microscopio toggle è impostata la microscopia a forza atomica contatto (AFM) mode. </li><li> Manualmente sollevare la testa SPM ruotando i suoi due regolabili dall&#39;utente manopole frontali. Staccare il tipholder AFM dalla testa SPM ruotando la vite di bloccaggio nella parte posteriore della testa. </li><li> Utilizzare delle pinzette per rimuovere il cantilever AFM esistente dal tipholder, poi accuratamente afferrare un nuovo sbalzo di nitruro di silicio (AFM sonda) dalla confezione e installarlo al posto del cantilever vecchia. Utilizzare un microscopio ottico per verificare che il cantilever appena installato AFM non è rotto. </li><li> Allega °cuticola e del campione di pomodoro (una sezione della cuticola di pomodoro parzialmente deparaffinati ~ 10 mm x 10 mm) su un disco in acciaio inox (campione puck) con nastro biadesivo. Utilizzare un microscopio ottico per verificare che la superficie cuticola rimane piatto e liscio dopo il posizionamento del campione sul disco. </li><li> Posizionare il disco con il campione pomodoro cuticola sulla regione magnetica nella parte superiore dello scanner SPM. </li><li> Impostare le prime due viti di regolazione manuale dello scanner ad alta ruotando le manopole, impostare la vite di regolazione motorizzata ritornato più o meno allo stesso livello delle altre due viti frontali. Assicurarsi che tutte e tre le viti siano abbastanza alto per evitare di rompere la punta AFM quando si posiziona il tipholder nella testa SPM. </li><li> Reinserire il tipholder nella testa SPM e fissarlo stringendo la vite di bloccaggio nella parte posteriore della testa. </li><li> Dopo aver acceso il laser, allineare il punto laser sul cantilever AFM utilizzando la centrale (y) e destro (x) manopole di regolazione laser sulla parte superiore della testa.Monitorare il fascio laser riflesso su un pezzo di carta per posizionare il punto laser esattamente al termine del cantilever AFM. </li><li> Regolare la posizione dello specchio mobile iterativamente con le manopole di regolazione fotorivelatore per ottenere massimo segnale (segnale di somma), assicurando così che il fascio laser riflesso viene ricevuto in modo uniforme i quattro quadranti del fotorivelatore. </li><li> Abbassare la punta AFM ritraendo i manuali viti anteriori di regolazione e la vite di regolazione motorizzata retro dello scanner SPM, monitorare visivamente l&#39;approccio della punta AFM verso la superficie del campione con un microscopio invertito. Assicurarsi che tutte e tre le viti siano allo stesso livello, per evitare artefatti dalle immagini di un campione inclinato. Portare la punta verso il campione, ma non così vicino che i tocchi di punta o interruzioni attraverso la superficie del campione. </li><li> A questo punto, la luce laser riflessa sul cantilever AFM rimbalzano lo specchio mobile al fotorivelatore. Per il modo AFM contatto con un siliAFM con nitruro di punta, impostare il segnale di OUTPUT (deflessione verticale) Tensione a -2 V per V 0 Setpoint e il segnale DIFF (verticale / orizzontale differenza) a 0 V regolando la posizione dello specchio. </li><li> Utilizzando il software Nanoscope, fare clic sull&#39;icona microscopio e selezionare il profilo appropriato (Contact modalità AFM). </li><li> Con la funzione &quot;Controlla le impostazioni di scansione&quot; pannello, impostare la velocità di scansione e le dimensioni ad esempio la scansione, 10 micron formato di scansione e 2 Hz frequenza di scansione. </li><li> Lasciare la punta AFM per impegnare la superficie del campione, fare clic sul impegnarsi punta icona. Controllando la vite motorizzata posteriore della base SPM, il programma sarà ora abbassare la punta fino ad impegnare la superficie del campione. Il processo di scansione si avvia automaticamente una volta che la punta si è impegnata con successo. </li><li> Monitorare il processo di scansione utilizzando entrambe le modalità di immagine e campo di applicazione del software, la regolazione dei parametri quali setpoint, guadagno integrale, guadagno proporzionale, dimensioni di scansione, velocità di scansione, linee e campioni per linea iterativo per ottenere il massimorisoluzione delle immagini. Avviare la scansione con un grande asse Z range (scala di dati), poi accuratamente ridurre il valore di scala di dati per osservare il miglior contrasto delle caratteristiche superficiali sull&#39;immagine. Minimizzare il verificarsi di aree bianche nell&#39;immagine scansionata, che indicano che l&#39;altezza delle caratteristiche superficiali supera la disposizione asse z gamma. </li><li> Cattura l&#39;immagine per salvare il file di dati, quindi elaborare i dati utilizzando le funzioni di spianatura per rimuovere artefatti dovuti alla verticale (Z) deriva scanner, archi di immagine, e verticale tra le linee di scansione; 9 Infine calcolare la rugosità media. Dopo aver salvato i dati, ritirare la punta AFM invertendo l&#39;azione del computer controllato motore della vite che è stato usato per farlo scattare. L&#39;elaborazione delle immagini può essere eseguita in modalità offline analisi delle immagini e / o utilizzando un computer diverso. </li><li> Utilizzare le manopole frontali in metallo grigio fondo del titolare punta a modificare le posizioni x e y dell&#39;area di scansione, quindi ripetere la misurazione a campione loca cinquezioni per verificare la riproducibilità, sostituendo il cantilever AFM se la qualità dell&#39;immagine si deteriora. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Spostamento Analisi chimica del CPMAS 13 C NMR (Fig. 3) ha identificato i principali gruppi funzionali presenti nella cuticola di pomodoro esaustivo deparaffinati (cutina). Le frazioni di carbonio chiave nella biopolyester cutina sono risultate alifatici a catena lunga (0-45 ppm), alifatici ossigenato (45-110 ppm), si moltiplicano-bonded e aromatici (110-160 ppm) e carbonili (160-220 ppm). Le frazioni alchiliche ossigenati (CHO + CH 2 O) svolgono un ruolo determinante nello stabilire connessioni covalenti tra le unità monomeriche del biopolimero cutina, formando in tal modo l&#39;architettura molecolare della matrice cutina. Le differenze nelle aree dei picchi relativi osservate nella regione spettrale tra 45 e 100 ppm suggeriscono che la cutina mutante ha una percentuale relativamente alta di cross-link di formazione CHO structura<html> frazioni l rispetto al wild-type cutina; attente misurazioni quantitative con polarizzazione diretta (DPMAS) NMR 5 metodi supportano questa inferenza (dati non riportati). CPMAS 13 C NMR ha mostrato un picco cera progressivamente decrescente a 31 ppm (Fig. 4), indicando la rimozione sequenziale di epi-e cere intracuticolare dal cutina-cera composito mantenendo l&#39;architettura principale chimica del biopolimero cutina. Parallela analisi dell&#39;immagine AFM (Fig. 5) ha rivelato irregolarità superficiali dovuti alla estrazione graduale di epi-e cere intracuticolare dalla cuticola frutta, significando alterazioni nell&#39;organizzazione del gruppo cuticolare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" /> . Figura 1 estrattore Soxhlet (fonte immagine: Wikipedia). &quot;/&gt; Figura 2. A) microscopio elettronico a scansione. B) SPM testa (tratto dal manuale di formazione AFM previste dagli strumenti digitali). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" /> Figura 3. 150 MHz CPMAS 13 C spettri NMR del esaustivo deparaffinati cuticole pomodoro frutta rossa matura (cutins) da wild-type (M82) e mutanti (CM15) mostrano risonanze con spostamenti chimici corrispondente ai gruppi funzionali di un reticolato acido hydroxyfatty poliestere a base ed anche alcune frazioni moltiplicano incollati. Tutti gli spettri sono stati acquisiti con una frequenza di 10 kHz filatura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" /> Figura 4. 150 MHz 13 CCPMAS spettri NMR delle cuticole commerciali pomodoro frutta rossa matura mostrano cambiamenti di composizione dopo la rimozione sequenziale delle cere epicuticular e intracuticolare mediante estrazione meccanica gomma arabica e un two minuti di cloroformio dip, rispettivamente. Tutti gli spettri sono stati acquisiti con una frequenza di 15 kHz filatura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" /> Figura 5. Immagini AFM e stime rugosità per il pomodoro parzialmente deparaffinati commerciale cuticole descritto in Figura 4, dopo la rimozione graduale di epicuticular (sinistra) e intracuticolare (destra) cere.

<ol>
	<li>Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+design+of+plant+cuticles:+an+overview.">The biophysical design of plant cuticles: an overview.</a> New Phytologist. 189, 938-949 (2011).</li><li>Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+plant+cuticle+and+cuticular+waxes+-+a+smart+material?.">Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material?.</a> Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).</li><li>Jetter, R., Sch&#228;ffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Composition+of+the+Prunus+laurocerasus+Leaf+Surface.+Dynamic+Changes+of+the+Epicuticular+Wax+Film+during+Leaf+Development.">Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development.</a> Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).</li><li>Vogg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties:+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+Î²-ketoacyl-CoA+synthase.">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid Î²-ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).</li><li>Isaacson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutin+deficiency+in+the+tomato+fruit+cuticle+consistently+affects+resistance+to+microbial+infection+and+biomechanical+properties,+but+not+transpirational+water+loss.">Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss.</a> Plant J. 60, 363-377 (2009).</li><li>Round, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Water+on+the+Nanomechanical+Behavior+of+the+Plant+Biopolyester+Cutin+as+Studied+by+AFM+and+Solid-State+NMR.">The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR.</a> Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).</li><li>Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Broadband+Decoupling+Sequence+for+Liquid+Crystals+and+Solids.">An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids.</a> J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).</li><li>Morcombe, C. R., Zilm, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+shift+referencing+in+MAS+solid+state+NMR.">Chemical shift referencing in MAS solid state NMR.</a> J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).</li><li>Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+atomic+force+microscopy+images+using+spectral+methods.">Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods.</a> J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).</li><li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+lipid+barriers:+biosynthesis+of+cutin+and+suberin.">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).</li><li>Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+structure+and+dynamics+in+fruit+cuticle+polyesters.">NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters.</a> Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).</li><li>Schaefer, J., Stejskal, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon-13+nuclear+magnetic+resonance+of+polymers+spinning+at+the+magic+angle.">Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle.</a> J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).</li><li>Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-State+NMR+Characterization+of+Pyrene-Cuticular+Matter+Interactions.">Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions.</a> Envir. Sci. &#38; Tech. 38, 4369-4376 (2004).</li><li>Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+cutin,+an+insoluble+plant+polyester.">Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester.</a> Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).</li><li>Stark, R. E., Garbow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+relaxation+studies+of+plant+polyester+dynamics.+2.+Suberized+potato+cell+wall.">Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall.</a> Macromolecules. 25, 149-154 (1992).</li><li>Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteronuclear+Decoupling+in+Rotating+Solids.">Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids.</a> J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).</li><li>Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ramped-Amplitude+Cross-Polarization+in+Magic-Angle-Spinning+NMR.">Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).</li><li>Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+CP-MAS+Signals+by+Variable-Amplitude+Cross-Polarization+-+Compensation+for+Inhomogeneous+B-1+Fields.">Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).</li><li>lessandrini, A., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+a+versatile+tool+in+biophysics.">AFM: a versatile tool in biophysics.</a> Measurement Sci. &#38; Tech. 16, 10-1088 (2005).</li><li>Ben&#237;tez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+plant+biopolyester+cutin+by+AFM+and+spectroscopic+techniques.">Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques.</a> J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).</li><li>Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+assembly+of+epicuticular+waxes+on+living+plant+surfaces+imaged+by+atomic+force+microscopy+(AFM).">Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM).</a> J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).</li><li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+A+Nanotool+in+Membrane+Biology.">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li><li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science.">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

I protocolli descritti consentono dettagliata caratterizzazione molecolare e microscala di un materiale complesso vegetale intrattabile senza la necessità di decomposizione chimica distruttiva. Per studiare la fusione del biopolyester cutina con vari lipidi (cere), che controllano l&#39;organizzazione strutturale del gruppo cuticolare, il 10 abbiamo condotto e monitorato le procedure per la rimozione selettiva di cere e epicuticular intracuticolare dalla fusione eterogenea cuticolare. Stato solido 13 C NMR è stato usato per misurare l&#39;estrazione dei componenti molecolari cera, e microscopia a forza atomica servita per esaminare conseguenti modifiche della ruvidità superficiale. 6,11 Per confrontare i reticolanti capacità di cutins da coltivata wild-type e singolo gene bacche di pomodoro mutanti, allo stato solido 13 C NMR è stato anche usato per stimare il numero relativo di CHO e CH 2 O porzioni chimiche. Un certo numero di funzionalità di progettaziones di questo protocollo sono notevoli. Poiché i materiali cera comprendono una vasta gamma di lipidi, trattando la cuticola frutta con una serie di solventi aventi polarità divergenti è essenziale per ottenere deparaffinazione esaustiva. Inoltre, il tempo di deparaffinazione può variare da 8 ore a 24 ore a seconda della natura dei campioni cuticola. Per estrarre cere epicuticular costantemente dalla cuticola frutto intatto, è indispensabile per applicare il rivestimento adesivo uniformemente alla superficie. Stato solido CPMAS 13 C NMR 12 è un metodo qualitativo rapido per identificare vari componenti strutturali di biopolimeri vegetali altamente insolubile eterogenei e mantenendo le caratteristiche fisiche nativi; 13 soluzione tradizionale-NMR allo stato può anche essere utilizzato per caratterizzare le miscele di cera estratti. Se la stima quantitativa dei gruppi funzionali si desidera per i polimeri pianta intatta, 5 ad alta fedeltà diretta polarizzazione magic-angle spinning (DPMA) 13 C NMR 5,14 deve essere utilizzato come metodo complementare. Quantificazione accurata dei gruppi funzionali richiede una attenta ottimizzazione dei tempi di ricarica, le lunghezze di impulso di eccitazione, e la forza di disaccoppiamento eteronucleari. 15 Il disaccoppiamento eteronucleari può essere impostata per una forza di campo H 1 da 50 kHz a 185 kHz utilizzando il TPPM 16 o SPINALI 7 metodologie. In aggiunta a questi parametri, la sensibilità di misurazione CPMAS dipende dalla spin-lock tempo e Hartmann-Hahn condizione di corrispondenza. 15 In luogo di CPMAS tradizionali, una rampa di ampiezza-CP (RAMP-CP) tecnica può essere implementata per massimizzare la croce -polarizzazione variando l&#39;efficienza di ampiezza 1 H linearmente (~ 20-50%) o tangenzialmente mantenendo l&#39;ampiezza di 13 intensità di campo C costante durante il periodo di spin-lock (o viceversa). 17,18 effettuare la misura in CPMAS un minimo di due ro diversetor-filatura frequenze è indispensabile per distinguere bande laterali filatura dalle vette principali spettrali. Simultanee effettuate misurazioni AFM in modalità contatto consentire l&#39;imaging diretto della condizione della superficie cuticola con velocità di scansione elevate e ad alta risoluzione, 19 per esempio durante la rimozione sequenziale di componenti cerose. Operativo AFM in maschiatura (senza contatto) può essere usato come alternativa per la caratterizzazione superficie di delicati &quot;soft&quot; materiali vegetali, evitando possibili danni dovuti a laterali (taglio) forze e raschiatura della superficie del campione. 5,20 In entrambi i casi , l&#39;acquisizione sequenziale di immagini multiple nello stesso punto sulla superficie serve per individuare eventuali danni alla superficie a causa della &quot;sonda-superficie interazioni&quot; nelle misurazioni AFM. 6,21 per la riproducibilità ottimale, sonde AFM con costanti elastiche adatte per superfici morbide cuticolari dovrebbe essere utilizzati, e costanza di temperatura e umidità deve essere mantenuta. 6,15,20 </sup&gt; considerando che la NMR a stato solido offre un profilo molecolare di ensemble media (bulk) immobili a cuticole frutto di pomodoro, l&#39;imaging a forza atomica fornisce una sonda complementare non invasiva 22,23 per il tracciamento della topografia superficiale di queste assemblee squisitamente complessi macromolecolari. 1,2

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog no.</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0026</td>
			<td>EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1184-100KU</td>
			<td>EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9967</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Extremely hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific Co.</td>
			<td>Model No.G24</td>
			<td>MFG No.M1036-000G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>31566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variac Controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sintered glass thimble (85 mm/25mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EMD-MX0485-7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RK20789</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-452</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1050-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89002-984</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9752</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 mm fastMAS zirconia rotor</td>
			<td>Varian (Agilent)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Varian 600 NMRS</td>
			<td>standard bore magnet</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49419</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adamantane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100277</td>
			<td>To calibrate 90&deg; pulse in NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA)</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip)</td>
			<td>Veeco (Bruker AXS)</td>
			<td>Model NP-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic puck</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit Peeler</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and biophysical study of fruit cuticles

La cuticola, uno strato idrofobico di protezione sulle parti aeree delle piante terrestri, funziona come una barriera difensiva versatile a diversi stress biotici e abiotici e regola anche il flusso di acqua dall&#39;ambiente esterno. 1 A biopolyester (cutina) e acidi grassi a catena lunga ( cere) costituiscono il quadro strutturale principale della cuticola, l&#39;integrità funzionale dello strato cuticolare dipende lo strato esterno &#39;epicuticular&#39; nonché la miscela consistente del biopolimero cutina e dei intracuticolare dei cere 2 Qui, si descrive un protocollo completo. per estrarre cere esaustivamente dal pomodoro commerciale (Solanum lycopersicum) cuticole di frutta o di cancellare cere epicuticular e intracuticolare in sequenza e in modo selettivo dal composito cuticola. Il metodo di Jetter e Schaffer (2001) è stato adattato per l&#39;estrazione graduale delle cere epicuticular e intracuticolare dalla cuticola frutto. 3,4 Per monitorare laprocesso di rimozione della cera sequenziale, a stato solido cross-polarizzazione-magic-angle spinning (CPMAS) 13 C NMR è stato utilizzato in parallelo con microscopia a forza atomica (AFM), fornendo profili strutturali a livello molecolare dei materiali sfusi integrata da informazioni sulle microscala la topografia e la rugosità delle superfici cuticolari. Per valutare le capacità di cross-linking di cuticole deparaffinati frutti coltivati ​​da wild-type e singolo gene di pomodoro mutanti, MAS 13 C NMR è stato utilizzato per confrontare le proporzioni relative di alifatici ossigenati (CHO e CH 2 O) porzioni chimiche. Deparaffinazione esaustivo per estrazione Soxhlet graduale con un pannello di solventi di varia polarità fornisce un mezzo efficace per isolare porzioni di cera in base alle caratteristiche idrofobiche della loro costituenti aromatici e alifatici, pur mantenendo la struttura chimica del biopolyester cutina. L&#39;estrazione meccanica di cere epicuticular e Selerimozione ctive di cere intracuticolare, quando monitorati da complementari metodologie fisiche, fornisce un mezzo senza precedenti per indagare il gruppo cuticola: questo approccio rivela l&#39;organizzazione strutturale supramolecolare e integrazione di vari tipi di cere, l&#39;architettura del cutina-cera matrice, e la chimica composizione di ciascun componente. Inoltre, allo stato solido 13 C NMR rivela differenze nei numeri relativi di CHO e CH 2 porzioni chimiche O per frutti rossi wild-type e mutanti pomodoro maturo. Le tecniche NMR offrono strumenti eccezionali per impronte la struttura molecolare dei materiali cuticolari che sono insolubili, amorfa, e chimicamente eterogeneo. Come non invasivo superficie selettiva tecnica di imaging, AFM fornisce uno strumento efficace e diretto per sondare l&#39;organizzazione strutturale del gruppo cuticolare sul nm-micron scala di lunghezza.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles at JoVE.com

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Organi della pianta aeree sono protetti dalla cuticola, uno supramolecolare biopolyester-cera di montaggio. Vi presentiamo i protocolli per monitorare la rimozione selettiva di epi-e cere intracuticolare da cuticole frutto di pomodoro su scala molecolare e micro da NMR allo stato solido e di microscopia a forza atomica, rispettivamente, e per valutare la capacità di cross-linking di ingegneria biopolyesters cuticolari.

Isolamento e studio della biofisica cuticole di frutta

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Views.  City College of New York, City University of New York Graduate Center and Institute for Macromolecular Assemblies. Organi della pianta aeree sono protetti dalla cuticola, uno supramolecolare biopolyester-cera di montaggio. Vi presentiamo i protocolli per monitorare la rimozione selettiva di epi-e cere intracuticolare da cuticole frutto di pomodoro su scala molecolare e micro da NMR allo stato solido e di microscopia a forza atomica, rispettivamente, e per valutare la capacità di cross-linking di ingegneria biopolyesters cuticolari.

Video: Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Ricerca

Biologia

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studiare Aggressione in Drosophila (moscerino della frutta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit aroma. Maturity at harvest is one of the key factors influencing the flavor quality of fruits and vegetables1. The validation of robust methods that rapidly assess fruit maturity and aroma quality would allow improved management of advanced breeding programs, production practices and postharvest handling. 
Over the last three decades, much research has been conducted to develop so-called electronic noses, which are devices able to rapidly detect odors and flavors2-4. Currently there are several commercially available electronic noses able to perform volatile analysis, based on different technologies. The electronic nose used in our work (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), consists of ultra-fast gas chromatography coupled with a surface acoustic wave sensor (UFGC-SAW). This technology has already been tested for its ability to monitor quality of various commodities, including detection of deterioration in apple5; ripeness and rot evaluation in mango6; aroma profiling of thymus species7; C6 volatile compounds in grape berries8; characterization of vegetable oil9 and detection of adulterants in virgin coconut oil10. 
This system can perform the three major steps of aroma analysis: headspace sampling, separation of volatile compounds, and detection. In about one minute, the output, a chromatogram, is produced and, after a purging cycle, the instrument is ready for further analysis. The results obtained with the zNose can be compared to those of other gas-chromatographic systems by calculation of Kovats Indices (KI). Once the instrument has been tuned with an alkane standard solution, the retention times are automatically converted into KIs. However, slight changes in temperature and flow rate are expected to occur over time, causing retention times to drift. Also, depending on the polarity of the column stationary phase, the reproducibility of KI calculations can vary by several index units11. A series of programs and graphical interfaces were therefore developed to compare calculated KIs among samples in a semi-automated fashion. These programs reduce the time required for chromatogram analysis of large data sets and minimize the potential for misinterpretation of the data when chromatograms are not perfectly aligned.
We present a method for rapid volatile compound analysis in fruit. Sample preparation, data acquisition and handling procedures are also discussed.

A rapid method for volatile compound analysis in fruit is described. The volatile compounds present in the headspace of a homogenate of the sample are rapidly separated and detected with ultra-fast gas chromatography (GC) coupled with a surface acoustic wave (SAW) sensor. A procedure for data handling and analysis is also discussed.

Fruit Analisi Volatile Utilizzando un naso elettronico

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Caratterizzazione biofisica delle funzioni flagellare a motore

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...