Sağlık hibe R01EY018144 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenir.

1. Holo-RBP üretimi, refolding ve HPLC Arıtma <ol><li> PET3a vektör N-ucu üzerinde 6x His etiketi olan insan RBP için cDNA barındıran BL-21cells dönüştürülmesi. 600 nm&#39;de OD kadar karbenisilin ile 40 mL LB ortamı içinde 37 ° C sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde transforme BL-21 hücrelerinin büyümesini 0,5 ulaşır. 1mM için IPTG ekleyerek RBP protein ekspresyonu øndükle. 37 bakteri büyümek ° C başka bir 5 saat. </li><li> E.coli &#39;de üretilen RBP çözünmeyen inklüzyon cisimcikleri çoğunlukla mevcuttur. 20 dakika boyunca 10.000 xg&#39;de inklüzyon cisimcikleri, pelet hücreleri zenginleştirmek. Sonra, dondurma ve buz çözme 2 döngüsü uygulayarak proteaz inhibitörleri ile birlikte 5 ml PBS içinde buz üzerinde hücreler sonikasyon. Pelet aşağı 4 az 30 dakika süreyle 20,000 x g inklüzyon gövdelerinin ° C. Süpernatantı ve buz üzerinde pelet tutun. </li><li> 10 ml 7.5 M guanidin hidroklorür sonication tarafından inklüzyon cisimciği pelet çözünür. Bir nihai C ile 25 mM Tris tamponu, pH 9.0 ve DTT bir yarım hacim (5 ml) ekleyin10 mM oncentration. Kuvvetlice tam olarak azaltmak ve proteinleri denatüre etmek için oda sıcaklığında gece boyunca bir vorteks mikseri üzerinde çözelti ilave edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika süre ile 18,000 x g çözünmeyen malzemelerin ayrılması için protein çözeltisi santrifüje Sıkma sonra, yeni bir tüp için supernatant aktarmak ve buz üzerine yerleştirilir. </li><li> Refolding tamponu dört hacim (60 mi) (25 mM Tris, pH 9.0, 0.3 mM sistin, 3.0 mM sistein, 1 mM EDTA) içinde hazırlayın. Degas refolding tampon. Ayrıca loş kırmızı ışık altında etanol 600 ul 10 mM retinol hazırlamak. Buz üzerinde karanlıkta saklayın. Refolding tampon ve retinol çözüm Hem taze hazırlanmış olması gerekir. </li><li> Protein çözeltisi ve en az 30 dakika boyunca buz üzerinde refolding tampon her ikisi de soğutulur. Yüksek sıcaklık olasılıkla RBP refolded kalitesini azaltır. 1 ml refolding tampon damlalar halinde ve sırayla 10 ul retinol çözelti protein çözeltisi şiddetle buz üzerinde bir behere karıştırılır iken ekleyin. Tüm refolding tampon ve retinol kadar bu adımı yineleyinilave edilir. 5 saat için karanlıkta buz üzerinde reaksiyon karıştırmaya devam edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle 24,000 x g refolding reaksiyon aşağı Spin Bu doğru refolding reaksiyondan sonra toplamları kaldırmak için esastır. </li><li> Yaklaşık 10 ml Amicon Ultra 15 konsantratör (MWCO 10 K) kullanarak süpernatant çözümü Konsantre. Bu seviyede daha refolded çözüm konsantre olmayın. Çok konsantre protein agregasyonunu yol ve doğru katlanmış RBP nihai verim ve kalitesini düşürür olacaktır. Soğuk PBS ile 100 mL&#39;ye konsantre örnek seyreltilir. Bu adımın amacı, nikel saflaştırma ile müdahale refolding reaksiyon bileşenleri ortadan kaldırmaktır. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika süre ile 24,000 x g çözelti bir kez daha Spin Bu, herhangi bir çökelti kaldırmak için önemlidir. Iki adet 50 ml&#39;lik tüp, PBS ile yıkandı her içeren 1 ml Ni-NTA bulamaç fazı aktarın. Bir saat boyunca 4 ° C&#39;de tüp döndürün. Seyreltilmiş çözelti f kuluçkayaya da 1 saat kaldırılması gerekir katlanan proteinleri çökelmesini neden olabilir. </li><li> 3 dakika boyunca 500 xg&#39;de tüpler aşağı spin. Dikkatli Süpernatantı. Her şey yüzer kaldırılması gerekir. Her bir tüp için 30 ml soğuk PBS ekleyin. Yeniden Spin ve süpernatant kaldırmak. Eğer tüp ama boncuk şey görene kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Boş bir sütun Ni-NTA reçine aktarın. 10 mM imidazol, PBS içinde 500 mM NaCl 20 kolon hacmi ile reçine yıkanır. PBS içinde 100 mM imidazol 5 kolon hacmi içinde His-RBP Zehir. Uzun bir süre için bu çözüm depolamak ve donma son verim ve kalitesini azaltır etmeyin. En iyi sonuç için, hemen HPLC ile RBP arındırmak. </li><li> 25 mM Tris, pH 8.4, ve 120 mM NaCl karşı Ni-NTA reçinesi saflaştırıldı His-RBP Dialyze. Bir yoğunlaştırıcı, aynı zamanda tampon değişimi için de kullanılabilir. ° C sağ Her koşudan önce 4 az 10 dakika süreyle 16,000 x g&#39;de santrifüj ile HPLC için Clear örnekleri. </li><li> Bir iyon kullanarak HPLC üzerinde sanal-RBP Purifydeğiş tokuş 1 ml / dakika hızında mobil faz olarak 25 mM Tris, pH 8.4 NaCl kullanarak bir adım gradyanı (12 dakika 220 mM, 360 mM, 15 dakika, ve 15 dakika 1,000 mM) ile sütun AX-300. NaCl konsantrasyonu arttıkça, holo-His-RBP apo-RBP ederken yayımlanan ve RBP sütun (Şekil 1) bağlı kalmak katlanan edilir. RBP refolding en iyi şekilde yapılmadığı takdirde, RBP (örneğin, Şekil 1 &#39;de RBP-I katlanan) tüm hazırlık ağırlıkta olabilir katlanan. </li><li> 360 mM NaCl doruk fraksiyonları doğru katlanmış holo-RBP kurtarın. Dikkatle doğru katlanmış ve His-RBP katlanan ve elüsyon profili izlemek. 1.000 mM NaCl anda, çoğu His-RBP serbest bırakılmalıdır katlanan. </li><li> Sanal-RBP ihtiva eden fraksiyonlar, toplanmış konsantre edildi ve 4 ° C de bir gece PBS&#39;ye karşı diyaliz edilmiştir Spektrofotometre ile son verim ve kalite (330 nm/280 nm) kontrol edin. Doğru katlanmış ürün 1 (Şekil 1) biraz daha yüksek bir 330 nm nm/280 oranında olmalıdır. </li><li> Üretimi içinE apo-RBP, saflaştırılmış holo-RBP için heptan eşit hacimde ekleyin ve 4 ° C gecede çevirerek hafifçe karıştırın 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 16,000 g de santrifüjlenir ve dikkatlice bir yeni tüpü (ara yüzeyde çökelti kaçınarak) ile alt sulu faz transfer edin. Her biri için 3 saat inkübasyon işlemi üç kez tekrarlayın. 330 nm tepe plan düzeyine inmiştir emin olmak için bir Nanodrop spektrofotometre üzerinde emilimini kontrol edin. </li></ol> 2. STRA6-katalizli Retinol Yayın ve Retinol Yükleniyor Gerçek zamanlı izleme <ol><li> 4 gecede Engelleyici Kazein (Pierce) 200 ul bir siyah 96-Microfluor-2 plaka (Thermo Scientific) Blok ° plastik holo-RBP nonspesifik yapışmasını önlemek için C. Engelleyici Kazein Denediğimiz tüm engelleme çözümlerinin iyi bloke edici etkisi verir. </li><li> Taze STRA6 ya da kontrol hücreleri ifade eden hücrelerden hazırlanan Zarlar bir Hamilton şırıngası (Gasti ile PBS ile yıkanmış ve geçirilirPBS içinde üniform bir süspansiyonu elde etmek için) 6 kere # 1710 GHT. Bu reaksiyon tipik olarak her bir 100 mm tabak üzerinde yetiştirilen hücreler 1/100 ile 1/20 &#39;dan türetilen membranlar kullanılır. </li><li> 200 ul PBS ile bir kez Microfluor-2 plaka kuyucuklar yıkayın. Membran süspansiyonu (kuyu başına 50 ul) ilave etmeden önce buz üzerinde plaka soğutulur. </li><li> Retinol floresans Gerçek zamanlı izleme eksitasyon filtresi 320ex ve emisyon filtresi 460-10 ile POLARstar Omega (BMG Labtech) floresans optikler kullanılarak ölçülür. Program Endpoint okuma moduna ayarlanır. Zaman aralıkları çeşitli takdirde Plaka Mod, aynı zamanda, bir zaman süreci ölçmek için kullanılabilir. Her bir zaman noktasında elde edilen sinyali 10 ölçüm (2 mm arasında bir çapa sahip orbital ortalama) ve ortalama ve kazanç 1.800 ayarlanır. Plakası her ölçümden önce çift yörüngesel titreme kullanarak 500 rpm&#39;de 10 saniye çalkalanır. </li><li> Retinol salınım testi başlatmak için, kuyular m okuma Endpoint kullanarak bir kez okunursanal-RBP önce gazel (tipik olarak 1 uM nihai konsantrasyon) 0 dak ilave edilir. En kısa sanal-RBP eklendiğinde, reaksiyon 1-3 saat için sürekli olarak her 5-10 dakikada izlenir. Retinol yükleme tahlil, all-trans retinol (tipik olarak 1 uM nihai konsantrasyon) başlatmak için soluk kırmızı ışık altında oyuklara ilave edilir. Apo-RBP 0 dakika önce ilave edilir plaka bir kez okunur. En kısa apo-RBP eklendiğinde, reaksiyon 1-3 saat için sürekli olarak her 5-10 dakikada izlenir. </li><li> Tüm ölçümler yapıldıktan sonra, veri analizi için Microsoft Excel Omega Veri Analizi yazılımı (BMG Labtech) ham verileri (Şekil 2&#39;de gösterildiği örnek) indirebilirsiniz. Her zaman noktasında tüm deneysel koşullar okumaları içeren bir dosya oluşturur. 20 kez puan varsa Örneğin, veri analizi için bir Excel dosyası içine 20 dosyaları birleştirmek. </li><li> Veri analizi için, 0 dak retinol veya sanal-RBP ilave edilmeden önce flöresan sinyalleri, bir arka plan sinyali olarak kabul edilird tüm zaman noktalarında nihai flöresan sinyalleri çıkarılır. Arka sinyaller düşük çıkarılarak, holo-RBP retinol floresans kıyasla rağmen arka membranlar tarafından ışık saçılma nonspesifik etkisini ortadan kaldırır ve 0 dakika ilave holo-RBP veya retinol retinol floresans odaklanmak mümkün kılar. </li></ol> 3. CRBP-I Holo-RBP kaynaktan Retinol arasında STRA6-katalizli Ulaştırma Gerçek zamanlı izleme <ol><li> Retinol-EGFP son 41 kurulmuş yeni bir floresan rezonans transferi (FRET) çiftidir. Holo-RBP gelen EGFP-CRBP-I retinol EGFP ölçerek gerçek zamanlı olarak izlenir STRA6-katalizli retinol ulaşım FRET. 6XHis etiketi (EGFP-CRBP-I) ile EGFP-CRBP-I füzyon proteini, memeli hücrelerinde üretilir ve deneyden önce Ni-NTA reçinesi üzerinde saflaştırılır. EGFP-CRBP-I 4 ° C de kısa bir süre için, proteaz inhibitörleri ile PBS içinde saklanabilir Alternatif olarak, füzyon proteini is -80 ° C küçük alikotları donduruldu. </li><li> Reaksiyon başlamadan önce, bir bloke edilmiş Microfluor-2 plaka ve yukarıda tarif edildiği gibi membranlar hazırlanır. Membran süspansiyonu (kuyu başına 50 ul) ilave etmeden önce 200 ul PBS ile bir kere Microfluor-2 plaka kuyucuklar yıkayın. </li><li> Gerçek-zamanlı retinol-EGFP FRET simültane emisyon düello floresan optik kullanılarak uyarma filtre 320ex ve emisyon filtre 460-10 ve 510-10 ile POLARstar Omega kullanılarak ölçülür. Program Endpoint okuma moduna ayarlanır. Zaman aralıkları çeşitli takdirde Plaka Mod, aynı zamanda, bir zaman süreci ölçmek için kullanılabilir. Her bir zaman noktasında elde edilen sinyali 10 ölçüm (2 mm arasında bir çapa sahip orbital ortalama) ve ortalama ve kazanç kanal başına 1.800 ayarlanır. Plakası her ölçümden önce çift yörüngesel titreme kullanarak 500 rpm&#39;de 10 saniye çalkalanır. </li><li> Reaksiyonları, EGFP-CRBP-I (tipik olarak 1 uM nihai konsantrasyon) başlamak için kuyu ilave edilir. Plaka okunurHolo-RBP önce Endpoint okuma modunu kullanarak ce 0 dakika eklenir. En kısa sanal-RBP eklendiğinde, reaksiyon ölçüm tarafından sürekli olarak 1-2 saat için her 5-10 dakikada izlenir. </li><li> Tüm ölçümler yapılır sonra, yukarıda tarif edildiği gibi veri analizi için, Microsoft Excel ile Omega veri analiz yazılımı gelen ham verileri (Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi örneğin) yükleyin. </li><li> Retinol-EGFP alıcı / verici emisyon zirveleri 47 oranında dinamik değişimi ile tespit edilir FRET. Bu oranı hesaplamak için denklem 41&#39;dir [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], burada 510 t, 510 b, 460 t ve 460 b reaksiyon başladıktan sonra 510 nm&#39;de emisyon temsil ( t = zaman noktası), retinol veya sanal-RBP önce 510 nm &#39;de tepkime (t = zaman noktası) başlandıktan sonra 460 nm&#39; de, (b = arka plan) ilave edilir ve retinol veya sanal-RBP önce 460 nm &#39;de ilave edilir (b = arka plan), sırasıyla. </li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

RBP Üretim ve saflaştırma prosedürleri doğru katlanmış RBP üretme açısından kritik önem taşımaktadır çünkü biz burada bir optimize RBP üretim protokolü paylaşabilirsiniz. Katlanan RBP tür olasılığı ve RBP bakteri üretimi dahi HPLC saflaştırılmış içinde bakteriyel proteinler, eser miktarda varlığı göz önüne alındığında, RBP ile ilgili bir sonuç teyit etmek için serum dan doğal RBP kullanmak yararlıdır. Piyasada mevcut İdrar RBP, apo-RBP ve sanal-RBP 48,49 dahil ...

A vitamini, insan yaşam ve hemen hemen tüm insan organlarının düzgün işleyişi için gerekli olan organik bir moleküldür. A vitamini türevleri (retinoidler) vizyon 1,2 ve embriyonik gelişim sırasında ve yetişkin dokularda 3-6 gen ekspresyonu ve protein çeviri düzenleme için ışık algılama dahil çeşitli biyokimyasal ve hücresel etkinliklere katılır. Retinol sistemik diffüz yeteneğine sahip olsa da, evrim plazma retinol bağlayıcı protein, vitamin yüksek verim ve spesifite elde etmek ve 7-10 rastgele difüzyon ile ilişkili toksisite önlemek için kan bir ulaşım için belirli bir taşıyıcı protein ile geldi. RBP bağlanır ve vitamin alır yüksek afiniteli reseptör A 1970&#39;lerde 11-13 varsayılmıştır. RBP reseptör 14-31 varlığını üç yıl içinde biriken kanıtlara rağmen, reseptör hipotezine nedeniyle existenc yıllarca tartışıldıHolo-RBP yanlış bir tanım e. Sanal-RBP arasında doğru bir tanımı da retinol ve RBP arasında yüksek afinite 01:01 karmaşık olmasıdır. Organik çözücü tarafından sanal-RBP Mükerrer ekstraksiyon apo-RBP üretmek için gereklidir. Bu tanım, RBP 7,9,32-35 veya RBP reseptör 14-31,36-42 okuyan hemen hemen tüm laboratuarlar tarafından kullanılır. RBP reseptörünün varlığı çürütmek için kullanılan sanal-RBP arasında yanlış tanım apo-RBP ile serbest retinol akut karışımıdır. Vitamin RBP reseptör fonksiyonu yana holo-RBP A alımını holo-RBP gelen retinol yayınlayacak retinol (as holo ve yanlış tanımı tarafından önerilen ile başlayan ücretsiz ise, RBP reseptör retinol alımını hiçbir rol oynayacak -RBP). Bir multitransmembrane etki protein olarak RBP reseptör son tanımlama STRA636 denilen ve vitamin işlevi holo-RBP 36-43 A alımını kuvvetle RBP değil hipotezi karşı savunuyorSTRA6 hücre içinde 40 bulunan bir transmembran 9 ekstraselüler yer alan N-terminus ile etki ve C-terminali sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır A vitamini detaylı analizler de teslim etmek için bir alıcı gereklidir. Transmembran 6 ve 7 arasında yer alan önemli bir RBP bağlayıcı alanı 39 olduğunu. STRA6 LRAT ve vitamin sanal-RBP A uptake CRBP-I hem de birleştirilmiştir, ancak LRAT, ne de CRBP-I tamamen gelişmiş bir etkinlik STRA6 41 için gereklidir. Olduğu Holo-RBP gelen retinol serbest katalize STRA6 yeteneği, onun A vitamini alımı etkinliği 41 için anahtardır. Onun retinol serbest STRA6 güvenerek, vitamin RBP A teslimat A vitamini yüksek özgüllük ve verimlilik ile periferik dokularda hücrelerin hedef taşıyabilir. Holo-RBP tanımı ve hazırlanması büyük önem holo-RBP tanımları dif esas ilgili üç yeni makale ile de RBP reseptörünün varlığı tarihsel tartışmayı tarafından sadece gösterildiği, ancaközgün ve doğru tanımını 44-46 den ferent. İlk kağıt RBP reseptörü 44 okumak için RBP reseptörünün varlığı reddetmek için kullanılan sanal-RBP tanım kullanılır. İkinci ve üçüncü kağıtlar bile daha az retinol için çalışılması gereken RBP 45,46 ile uygun bir kompleks oluşturur yapılan sanal-RBP üçüncü bir tanımı ile geldi. Bu çalışmalar 3 H-retinol ile sanal-RBP (bile apo-RBP) karıştırılarak 3 H-retinol/RBP hazırlanmıştır. Bu testte 3 H-retinol/RBP oluşmuş ve aşırı ücretsiz 3 H-retinol 45,46 çıkarmadılar yoktu bu yana, 3 H-retinol/RBP 3 H-retinol alımı için bir test değil, ama ücretsiz bir 3 H-retinol difüzyon testi. Bu STRA6 LRAT 38 ya da CRBP-I 41 oranında serbest retinol hücre alımını artırmak olmadığı önceden gösterilmiştir. Hemen hemen tüm retinol kan içinde RBP bağlı olduğu ve hiçbir saptanabilir fre yokture retinol. RBP reseptör A ana işlevi holo-RBP 41&#39;den retinol alımı sırasında holo-RBP gelen retinol serbest katalize etmektir. Retinol yapay olarak serbest ya da 45,46 ile başlamak için, serbest formdaki olduğu takdirde, RBP reseptör gerekli değildir. Doğru sanal-RBP RBP bu doğru hazırlanmasını göstermektedir hazırlanan esas testleri ile karşılaştırıldığında serbest retinol difüzyon testi elde ölçüde farklı sonuçlar fonksiyonel testler için çok önemlidir. RBP insan serum den 41 arıtılmış, fakat bu işlem oldukça karmaşıktır ve düşük verim edilebilir. Alternatif bir yaklaşım, E. RBP üretmek için coli. Çünkü E. coli düzgün RBP gibi disülfid bağlarının birden fazla çift memeli salgılanan proteinler pas yeteneğine sahip değildir, katlanamayan RBP ve doğru katlanmış proteini saflaştırmak için gereklidir. Katlanan proteinleri sadece, farklı çeşitli testler giderilmiştir katlanmış RBP gelen davranmazfakat aynı zamanda saklama esnasında protein agregasyonu neden olur. Aynı nedenle, apo-RBP sadece yüksek kaliteli sanal-RBP üretilir. Biz kaliteli RBP bakteriyel ifade refolding ve HPLC arıtma yoluyla retinol ile yüklenen% 100 üretmek için burayı optimize edilmiş protokol açıklar. HPLC saflaştırma yanlış katlanmış RBP değil, aynı zamanda RBP sinyal transdüksiyon testlerin kullanılması durumunda ciddi eşya neden olabilir önemli bakteriyel kontaminasyon kaldırır sadece. Biz de STRA6 tarafından retinol ulaşım incelemek için iki hassas gerçek zamanlı izleme teknikleri anlatıyoruz. Her iki teknikler kaliteli RBP bağlıdır. Alanı sınırlamaları nedeniyle, radyoaktif retinoid tabanlı ve HPLC bazlı vitamin klasik teknikler alımını deneyleri burada yer verilmemiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> guanidin hidroklorür </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> sistin </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> sistein </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Balıkçı </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Balıkçı </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> karbenisilin </td><td> Balıkçı </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Balıkçı </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptan </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Engelleyici Kazein </td><td> Delmek </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 konsantratör (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 plaka </td><td> Balıkçı </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton şırınga Gaz Geçirmez # 1710 </td><td> Balıkçı </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

A vitamini görme için gerekli olan ve büyüme / neredeyse bütün insan organlarının farklılaşması. Plazma retinol bağlayıcı protein (RBP) A kan ilke ve vitamin belirli taşıyıcısıdır. İşte biz üretmek ve yüksek afinite RBP reseptör STRA6 tarafından A vitamini ulaşım incelemek için holo-RBP ve iki gerçek zamanlı izleme teknikleri arındırmak için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar. İlk teknik mümkün yüksek kaliteli vitamini için holo-RBP (100 retinol ile% yüklenmiştir) A ulaşım testlerinin büyük miktarda üretmek için yapar. RBP bültenleri vitamini RBP hazırlanmasında bir kolaylıkla ve bakteriyel kontaminasyon eserler neden olabilir katlanan çünkü Yüksek kalite RBP fonksiyonel testleri için gereklidir. Elektrofizyoloji gibi Gerçek zamanlı izleme teknikleri membran taşıma çalışmaları için kritik katkılarda bulunmuşlardır. RBP reseptör-aracılı retinol taşıma gerçek zamanlı olarak yakın zamana kadar analiz edilmemiştir. Burada anlatılan ikinci teknik rea olduğunuSTRA6-katalizli retinol serbest veya yükleme l-zaman analizi. Üçüncü tekniği holo-RBP gelen hücresel retinol bağlayıcı protein I (CRBP-I) STRA6-katalizli retinol taşıma gerçek zamanlı analiz. Bu teknikler RBP reseptörün A vitamini alımı mekanizmayı açıklamada, yüksek hassasiyet ve çözünürlük sağlar.

Biz sanal-RBP ve retinol yükleme apo-RBP içine (Şekil 2) ve gerçek zamanlı analiz itibaren STRA6-katalizli retinol serbest HPLC ile sanal-RBP üretimi ve saflaştırılması (Şekil 1), gerçek zamanlı analiz için buraya temsilcisi sonuçları sunmak Holo-RBP gelen EGFP-CRBP-I STRA6-katalizli retinol taşımacılığı (Şekil 3). Hemen hemen tamamen yanlış bir çok disülfid bağların varlığı nedeniyle katlanan bir refolding ol...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Burada yüksek kaliteli vitamin A / RBP karmaşık ve STRA6, RBP reseptör tarafından A vitamini ulaşım incelemek için iki gerçek zamanlı izleme teknikleri üretmek için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar.

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Burada yüksek kaliteli vitamin A / RBP karmaşık ve STRA6, RBP reseptör tarafından A vitamini ulaşım incelemek için iki gerçek zamanlı izleme teknikleri üretmek için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar.

Video: Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biyoloji

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Floresans Rezonans Enerji Transferi Ligand-reseptör etkileşimleri gerçek zamanlı izleme

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...