Ce projet a appuyé en partie par l&#39;Université Johns Hopkins, Bureau du prévôt par le Science Initiative passerelle et Qiagen Inc.

Introduction: Une colonie bactérienne unique devrait être utilisée pour inoculer un bouillon de culture approprié qui est incubé pendant une nuit. Un culot bactérien est ensuite traitée pour purifier l&#39;ADN génomique en utilisant un kit d&#39;isolation de génomique disponible dans le commerce. L&#39;ADN génomique purifié doit avoir un rapport 260/280 (nm)&gt; 1,8 à assurer que l&#39;échantillon est exempt de contamination par des protéines. La quantité d&#39;ADN génomique nécessaire pour la génération de la matrice est de 10 à 20 ng pyroséquençage. A. amplification de la matrice (Manuel PCR PyroMark; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / manuels</a> 1) Mise en place de la réaction PCR Note: Une amorce doit être biotinylé à son extrémité 5 &#39;, et il est recommandé qu&#39;elle soit purifiée par HPLC pour la préparation du modèle. Nous recommandons l&#39;PyroMark Assay conception Software 2.0 pour la PCR et seconception d&#39;amorce de séquence qui sont optimisés pour le séquençage de courte lecture, cependant, Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> ) de NCBI pouvez également être utilisé pour la conception d&#39;amorces. <ol><li> Décongeler les solutions requises (listées dans le tableau 1) et mélanger soigneusement chaque. Mettre en place la réaction selon le tableau 1. Tout le travail peut être fait à la température ambiante. </li></ol> Note: Le PCR Master Mix contient MgCl2 pour une concentration finale de 1,5 mm, ce qui donne des résultats satisfaisants dans la plupart des cas. Si un Mg 2 + concentration plus élevée est requise, jusqu&#39;à 3,5 ul de 25 mM MgCl 2 peut être ajouté à une réaction. <ol start="2"><li> Bien mélanger le mélange réactionnel par un léger pipetage de haut en bas, puis distribuer des volumes appropriés dans des tubes PCR. </li><li> Ajouter template ADN dans chaque tube PCR. Nous recommandons 10 ng d&#39;ADN génomique. </li><li> Programmer le thermocycleur selon le tableau 2. Une prise finale à 4 ° C est recommandé pour plus de commodité. Si vous utilisez un cycleur thermique sans couvercle chauffant, les réactions de superposition avec huile minérale 100 pi. </li><li> Placer les tubes PCR dans le thermocycleur et démarrer le programme de cyclisme. </li></ol> B. vide Protocole Workstation Immobiliser les produits de PCR biotinylés <ol><li> Faites un mélange-maître selon la figure 4. </li></ol> Remarque: Avant de pipetage, secouez doucement la bouteille de billes de Sepharose revêtues de streptavidine pour assurer une suspension homogène. <ol start="2"><li> Selon le volume de produit de PCR utilisé, dispenser 60-75 ul mélange maître dans chaque puits d&#39;une plaque PCR pour obtenir un volume total de 80 pi par puits. </li><li> Ajouter 5-20 ul produit PCR biotinylé à chaque puits. </li><li> Sceller le puits avec bande caps et agiter la plaque PCR à 1400 rpm pendant 5-10 min à température ambiante (15-25 ° C) en utilisant un agitateur orbital. </li></ol> La dénaturation de l&#39;ADN et l&#39;addition d&#39;amorce de séquençage <ol><li> Diluer les amorces de séquençage à 0,3 um avec un tampon d&#39;hybridation et de distribuer 25 ul dans chaque puits d&#39;une plaque de réaction. Placer la plaque sur le poste de travail. </li><li> Remplir les auges de poste de travail selon le schéma de la figure 5. </li><li> Tournez sur la pompe à vide, et assurez-vous que l&#39;interrupteur de l&#39;outil à vide est activée (Figure 6). Rincer les sondes filtre à l&#39;eau de haute pureté (Milli-Q 18,2 MW x cm ou équivalent) en creux 5 (figure 5). Remplir le creux avec de l&#39;eau de haute pureté frais pour l&#39;utilisation dans l&#39;étape 12. </li><li> En travaillant rapidement, positionner la plaque PCR avec des perles sur le poste de travail. S&#39;assurer que les deux plaques sont dans la même orientation que quand les échantillons ont été chargés. </li><li> Avec le passage à vide en marche, abaissez le videoutil dans les puits de la plaque PCR pendant 20 secondes ou jusqu&#39;à ce que le volume a été aspiré. Les billes seront capturés par l&#39;outil à vide (figure 7). </li><li> Avec le vide toujours ON, rincer l&#39;outil avec 70% d&#39;éthanol (bac 1) pendant 20 secondes ou jusqu&#39;à ce que le volume a été aspiré. </li><li> Avec vide ON, rincer l&#39;outil avec une solution de dénaturation (bac 2) pendant 20 secondes ou jusqu&#39;à ce que le volume a été aspiré. </li></ol> Note: La Solution de dénaturation contient de l&#39;hydroxyde de sodium, qui est un irritant oculaire et cutanée. Toujours porter une blouse, des gants et des lunettes de protection. <ol start="8"><li> Avec ON vide, rincer avec l&#39;outil tampon de lavage (bac 3) pendant 20 secondes ou jusqu&#39;à ce que le volume a été aspiré. </li><li> Avec vide ON, soulever l&#39;outil à vide pour au-delà de 90 ° à la verticale pendant 5 secondes, pour permettre à tout le liquide à s&#39;écouler hors de l&#39;outil à vide. Arrêtez la pompe et aligner l&#39;outil à vide avec la plaque de réaction. Abaisser l&#39;outil à vide dans l&#39;puits et agiter doucement de gauche à droite pour libérer les billes dans le contenant amorce de séquençage puits. </li><li> Afin de nettoyer l&#39;outil à vide, agiter les sondes filtre à l&#39;eau de haute pureté (bac 4) pendant 10 sec. </li><li> Passez l&#39;aspirateur en marche et rincer l&#39;outil avec de l&#39;eau de haute pureté (creux 5) pendant 20 secondes ou jusqu&#39;à ce que le volume a été aspiré. </li><li> Soulevez l&#39;outil à vide au-delà de 90 ° C vertical pendant 5 secondes, puis passer l&#39;aspirateur hors tension et stocker dans la position &quot;parking&quot;. </li></ol> Recuit amorce de séquençage de brins d&#39;ADN <ol><li> Placer la plaque de réaction dans un support de plaque de pré-chauffé. </li><li> Chauffer la plaque sur un bloc de chauffage à 80 ° C pendant 2 min. </li><li> Retirer la plaque du support et le déposer sur le comptoir pour refroidir à la température ambiante pendant 5 min. </li></ol> PyroMark Q24 opération Note: Allumer l&#39;appareil en utilisant l&#39;interrupteur d&#39;alimentation situé au-dessus du cordon d&#39;alimentation. Étoiletup peut prendre jusqu&#39;à 1 min. <ol><li> Remplir une cartouche en suivant les instructions fournies dans le PyroMark Or Q24 Réactifs Manuel 2. Pour déterminer les volumes nécessaires, mettre en place un fichier courir dans le logiciel de l&#39;instrument, et sous le menu Outils, sélectionnez Information préalable Run </li><li> Si l&#39;instrument est déjà allumé, veiller à ce qu&#39;il ne remplit pas une course, puis ouvrez le couvercle. Un signal d&#39;avertissement sonore est émise lorsque le couvercle est ouvert quand il est dangereux de faire. </li><li> Ouvrez la porte cartouche et insérez la cartouche avec l&#39;étiquette vers l&#39;avant (figure 8). Assurez-vous que la cartouche est insérée correctement (une ligne doit être visible à l&#39;avant) et fermer la porte. </li><li> Ouvrez le cadre plaque de rétention et positionner la plaque avec des échantillons à l&#39;intérieur de l&#39;instrument. </li><li> Fermer le châssis de plaque de maintien et le couvercle de l&#39;appareil (figure 9). </li></ol> Démarrage d&#39;une course <ol><li> Insérez la clé USB avec le fichier d&#39;exécutions créé avec le logiciel de l&#39;appareil dans le port USB à l&#39;avant de l&#39;instrument. </li><li> Sélectionnez &quot;Exécuter&quot; dans le menu principal et appuyez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Utilisez les flèches de défilement pour sélectionner le fichier d&#39;exécution désiré et appuyez sur &quot;Select&quot;. </li></ol> Note: L&#39;instrument commence la distribution de réactifs lorsque tous les niveaux de pression et de température prédéfini est atteint (cela peut prendre plusieurs minutes). Au cours d&#39;une course, l&#39;écran de l&#39;appareil affiche le pyrogramme du puits sélectionnés en temps réel. Utilisez les flèches de défilement pour afficher le pyrogramme d&#39;autres puits. Remplir une course <ol><li> Lorsque l&#39;instrument confirme que la course est terminée et le fichier d&#39;exécution a été enregistré sur la clé USB, appuyez sur &quot;Fermer&quot;. </li><li> Retirez la clé USB. Si elle a été retirée avant la course terminée, insérez la clé USB. Sélectionnez &quot;Administration&quot; puis &quot;Copier Runs non enregistrées». </li><li> Le fichier d&#39;exécution peut être ouvert et analysées en utilisant le logiciel de l&#39;appareil et comparéà une bibliothèque de microbes connus en utilisant le logiciel Identifire. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

Production et le libre accès à cet article est parrainé par Qiagen. Auteurs Ahmed, Durocher, Jessen et Vardi sont des employés de Qiagen Inc. qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

Plusieurs nouvelles méthodes de séquençage de nouvelle génération ont été commercialisés. Trois des méthodes les plus couramment utilisés sont le séquençage ion des semi-conducteurs, le séquençage en temps réel de la molécule unique, et le séquençage par synthèse (SBS). 3-11 Chacune de ces méthodes dépend de séquençage par synthèse, mais emploient de nouvelles plates-formes pour la détection des nucléotides incorporés. Dans ion semiconducteur séquençage, un simple brin d&#39;ADN servant de matrice pour le brin de séquençage. Polymérase et 12 nucléotides sont ajoutés séquentiellement comme dans pyroséquençage. Quand un nucléotide est ajouté au brin d&#39;ADN en croissance, un ion d&#39;hydrogène est libéré. L&#39;ion d&#39;hydrogène est détecté par un capteur à effet à base de transistors de champ. Molécule unité séquençage en temps réel dépend du guide d&#39;ondes en mode zéro (ZMW). 13 Le ZMW est une petite structure où une seule molécule de la polymérase est fixé au fond du puits. Il est éclairé de telle manière qu&#39;une floreMolécule d&#39;odeur peut être détectée. Chaque nucléotide est étiqueté avec une molécule fluorescente. Comme un nucléotide marqué par fluorescence est incorporé, un détecteur identifie le nucléotide. Lorsque le nucléotide suivant est ajouté, la molécule fluorescente est clivé. 14 Le séquençage par synthèse (SBS) utilise une méthode unique pour amplifier l&#39;ADN cible de sorte que des groupes de séquences uniques sont générés. 15 gabarits simples brin sont générées, puis le brin complémentaire est synthétisé. Chaque nucléotide est marqué avec une molécule fluorescente et après chaque addition de base de la fluorescence de la base ajoutée est enregistrée.

Pyroséquençage est une méthode rapide et précise aux acides nucléiques de séquence qui est basé sur le principe de la &quot;séquençage par synthèse&quot;. &quot;Le séquençage par synthèse&quot; implique l&#39;utilisation d&#39;une seule matrice d&#39;ADN de brin pour synthétiser le brin complémentaire d&#39;une base en même temps, et la détection de la base constituée (A, T, G ou C), à chaque étape de détection d&#39;un signal chimiluminescent. La réaction pyroséquençage comprend matrice d&#39;ADN, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), l&#39;ADN polymérase, ATP sulfurylase, la luciférine, la luciférase, et apyrase. La réaction de synthèse est initiée par l&#39;addition de l&#39;un des quatre dNTP et de l&#39;ADN polymérase de l&#39;ADN matrice simple brin biotinylé. ADN polymérase incorpore le dNTP complémentaire sur le modèle, avec la libération subséquente de pyrophosphate (figure 1). ATP sulfurylase convertit proportionnellement le pyrophosphate à l&#39;ATP. ATP agit comme un catalyseur pour la conversion de l&#39;intermédiaire de luciférase de la luciférine à oxyluciférine, quigénère de la lumière (Figure 2). L&#39;intensité de la lumière est proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés et détermine s&#39;il ya une ou plusieurs dNTP spécifique (dATP, dTTP, dGTP, dCTP ou) est présent sur ​​le brin matrice de façon séquentielle (figure 3). Toute dNTP non incorporée est dégradée par l&#39;apyrase avant l&#39;addition de la prochaine dNTP pour la poursuite de la réaction de synthèse. Cette &quot;séquençage par synthèse&quot; réaction est répété avec addition de chacune des quatre dNTP jusqu&#39;à ce que la séquence d&#39;ADN de la matrice d&#39;ADN monocaténaire est déterminée. Pour visualiser une animation de la réaction pyroséquençage <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> .

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

Pyroséquençage est une technique polyvalent qui facilite le séquençage du génome microbien qui peut être utilisé pour identifier des espèces bactériennes, de discriminer les souches bactériennes et de détecter des mutations génétiques qui confèrent une résistance aux agents anti-microbiens. Les avantages de pyroséquençage pour des applications microbiologiques comprennent criblage à haut débit rapide et fiable et une identification précise des microbes et des mutations du génome microbien. Pyroséquençage comprend le séquençage de l&#39;ADN en synthétisant le brin complémentaire d&#39;une base unique à la fois, tandis que la détermination de l&#39;être nucléotidique spécifique incorporé au cours de la réaction de synthèse. La réaction se produit sur la matrice ADN simple brin immobilisé, où les quatre désoxyribonucléotides (dNTP) sont ajoutés de façon séquentielle et les dNTP non incorporées sont dégradés par voie enzymatique avant l&#39;addition de la prochaine dNTP à la réaction de synthèse. Détection de la base spécifique incorporé dans la matrice est contrôlée par la génération d&#39;chemilumsignaux inescent. L&#39;ordre des dNTP qui produisent des signaux chimiluminescents détermine la séquence d&#39;ADN de la matrice. La capacité de séquençage en temps réel de la technologie de pyroséquençage permet l&#39;identification microbienne rapide dans un seul essai. En outre, l&#39;instrument pyroséquençage, permet d&#39;analyser la diversité génétique complète de la résistance aux médicaments anti-microbienne, y compris le typage des SNP, mutations ponctuelles, insertions et suppressions, ainsi que la quantification de multiples copies du gène qui peuvent survenir dans une certaine résistance anti-microbienne motifs.

Les résultats d&#39;une course de pyrosequencing typique utilisant le logiciel montre l&#39;emplacement des amorces sens et antisens utilisées pour la production d&#39;amplicon, et l&#39;amorce de séquençage utilisée pour la réaction de pyroséquençage dans le 16S séquence ribosomique conservé (Figure 10). L&#39;séquence hypervariable entre le primaire des sites permet d&#39;identification bactérienne d&#39;un grand nombre d&#39;espèces bactériennes à l&#39;aide de l&#39;amorce de séquençage conservée (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Comme un contrôle interne de la qualité, la mise entre parenthèses de la séquence d&#39;ADN de la région variable peut être contrôlé pour assurer que la région d&#39;ADN correcte a été analysé . Le logiciel permet de comparer pyroséquençage et l&#39;alignement de la séquence générée à une base de données interne de séquences ribosomiques bactériens d&#39;identification bactérienne. En outre, une séquence peut être analysé afin de déterminer les mutations qui confèrent une résistance aux antibiotiques. Par exemple, l&#39;analyse des mutations dans les gènes ribosomique 23S de Helicobpylori tère montre deux profils de mutation (GAA ou AGA) qui confèrent une résistance aux antibiotiques (Figure 11). L&#39;analyse de plusieurs isolats du même patient peut être en même temps dosé pour suivre l&#39;émergence de la résistance aux médicaments au fil du temps pour les enquêtes épidémiologique des foyers de résistance aux médicaments microbiennes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Figure 1. Produit PCR biotinylé est utilisé comme modèle pour incorporer dNTP par l&#39;ADN polymérase, conduisant à la génération de pyrophosphate (PPi). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Figure 2. ATP sulfurylase convertit proportionnellement pyrophosphate de l&#39;ATP. ATP agit comme un catalyseur pour la conversion de l&#39;intermédiaire de luciférase de la luciférine à oxyluciférine, qui génère de la lumière qui est proproportionnel à la quantité d&#39;ATP. La lumière est enregistrée en pointe sur la trace de pyrogramme et indique incorporation de nucléotides. Les dNTPs non constituées en société sont dégradées par apyrase avant la prochaine dNTP est ajouté pour la suite de la synthèse. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Figure 3. L&#39;intensité de la lumière générée indique si a été constituée de une ou plusieurs dNTP spécifique (dATP, dTTP, dGTP, dCTP ou) sur le brin matrice de manière séquentielle. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Figure 4. Diagramme pour la préparation du master mix pour immobiliser le produit PCR biotinylé. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> GE = &quot;always&quot;&gt; Figure 5. PyroMark poste de travail, avec plaque PCR, plaque PyroMark et lieux de dépression. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> Figure 6. Emplacements de l&#39;interrupteur à vide positions ON et OFF. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Figure 7. outil à vide. d&#39;une manipulation correcte de l&#39;outil à vide. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Figure 8. Porte cartouche ouverte avec cartouche en place. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> Figure 9. Cartouche insérée correctement avec la porte fermée. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> Figure 10. Pyroséquençage résultats de l&#39;identification de bactéries à base de. Amorces de PCR sont conçus pour les régions conservées de la matrice d&#39;ADN et l&#39;amorce de séquençage est positionné immédiatement en amont d&#39;une identification de la séquence d&#39;ADN hypervariable bien caractérisé dans le amplicon (en bleu). <img alt="Figure 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> Figure 11. La détection de la résistance aux antibiotiques dans Helicobacter pylori en utilisant pyrosequencing. Analyse des mutations dans les gènes 23S qui confèrent une résistance antibactérienne à Helicobacter pylori contenant la GAA ou séquences AGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Composant </td><td> Volume par réaction </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 pi </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Concentré CoralLoad, 10x </td><td> 2,5 pl </td><td> 1x </td></tr><tr><td> MgCl2 25 mM (facultatif) </td><td> Variable </td><td> ≥ 1,5 mM </td></tr><tr><td> Q-Solution, 5x (facultatif) </td><td> 5 pl </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / B Primer </td><td> Variable / Variable </td><td> 0,2 μM/0.2 iM </td></tr><tr><td> Eau sans RNase </td><td> Variable </td><td> - </td></tr><tr><td> Volume total (après avoir ajouté l&#39;ADN matrice) </td><td> 25 pl </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. PCR mélange réactionnel. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Autres commentaires </td></tr><tr><td> Étape d&#39;activation initiale PCR </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq ADN polymérase est activé </td></tr><tr><td> 3 étape cyclisme: Dénaturation </td><td> 30 sec </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Recuit </td><td> 30 sec </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Pour l&#39;ADN génomique Pour l&#39;ADN converti au bisulfite </td></tr><tr><td> Prolongement </td><td> 30 sec </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Nombre de cycles </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Extension finale </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. PCR caractéristiques du cycle.

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Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyroséquençage est une technique polyvalent qui facilite le séquençage du génome microbien qui peut être utilisé pour identifier des espèces bactériennes, de discriminer les souches bactériennes, et de détecter des mutations génétiques qui confèrent une résistance aux agents anti-microbiens. Dans cette vidéo, la procédure pour la production microbienne de l&#39;amplicon, amplicon pyrosequencing et analyse de la séquence d&#39;ADN sera démontrée.

Pyrosequencing pour l&#39;identification microbienne et Caractérisation

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

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46.9K vues.  Johns Hopkins University. Pyroséquençage est une technique polyvalent qui facilite le séquençage du génome microbien qui peut être utilisé pour identifier des espèces bactériennes, de discriminer les souches bactériennes, et de détecter des mutations génétiques qui confèrent une résistance aux agents anti-microbiens. Dans cette vidéo, la procédure pour la production microbienne de l'amplicon, amplicon pyrosequencing et analyse de la séquence d'ADN sera démontrée.

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Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Les communautés microbiennes dans la Nature et de laboratoire - Interview

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Biologie

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologie des communautés microbiennes - Interview

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyroséquençage: une méthode simple pour le génotypage précis

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolement des régions génomiques spécifiques et l&#39;identification des molécules associées par enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Analyse de végétaux de promoteur : Identification et caractérisation de racine Nodule promoteur spécifique chez le haricot commun

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocole de guidée pour la caractérisation microbienne fécale par 16 s rRNA-Amplicon séquençage

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as regulators of various biological processes. Notably, emerging evidence demonstrates that host circRNAs can be differentially expressed (DE) upon infection with&#160;pathogens (e.g., influenza and coronaviruses), suggesting a role for circRNAs in regulating host innate immune responses. However, investigations on the role of circRNAs during pathogenic infections are limited by the knowledge and skills required to carry out the necessary bioinformatic analysis to identify DE circRNAs from RNA sequencing (RNA-seq) data. Bioinformatics prediction and identification of circRNAs is crucial before any verification, and functional studies using costly and time-consuming wet-lab techniques. To solve this issue, a step-by-step protocol of in silico prediction and characterization of circRNAs using RNA-seq data is provided in this manuscript. The protocol can be divided into four steps: 1) Prediction and quantification of DE circRNAs via the CIRIquant pipeline; 2) Annotation via circBase and characterization of DE circRNAs; 3) CircRNA-miRNA interaction prediction through Circr pipeline; 4) functional enrichment analysis of circRNA parental genes using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). This pipeline will be useful in driving future in vitro and in vivo research to further unravel the role of circRNAs in host-pathogen interactions.

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

The protocol submitted here explains the complete in silico pipeline needed to predict and functionally characterize circRNAs from RNA-sequencing transcriptome data studying host-pathogen interactions.

À Silico Identification et caractérisation des ARNcirc au cours des interactions hôte-pathogène

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...