Este proyecto se apoyó en parte por la Universidad Johns Hopkins, Oficina del Rector a través de la Iniciativa Científica Gateway y Qiagen Inc.

Introducción: Una sola colonia bacteriana se debe utilizar para inocular un caldo de cultivo apropiado que se incubó durante la noche. Un sedimento bacteriano se procesa a continuación para purificar ADN genómico usando un kit de aislamiento genómico disponibles comercialmente. El ADN genómico purificado debe tener una relación de 260/280 (nm)&gt; 1,8 para asegurar que la muestra está libre de contaminación de proteína. La cantidad de ADN genómico se requiere para la generación de la plantilla de pirosecuenciación es de 10-20 ng. A. Ampliación de la plantilla (Manual de PCR PyroMark; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / manuales</a> 1) Configuración de la reacción de PCR Nota: Un cebador debe biotinilado en su extremo 5 &#39;, y se recomienda que sea HPLC purificada para la preparación de la plantilla. Recomendamos el PyroMark Ensayo Diseño de Software 2.0 para PCR y SEprimer diseño cuencia que están optimizados para la secuenciación de corta lectura, sin embargo, Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> ) de NCBI también puede ser utilizado para el diseño del cebador. <ol><li> Descongelar todas las soluciones requeridas (enumerados en la Tabla 1) y mezclar a fondo cada uno. Configurar la reacción de acuerdo con la Tabla 1. Todo el trabajo se puede realizar a temperatura ambiente. </li></ol> Nota: La mezcla maestra de PCR contiene MgCl 2 para una concentración final de 1,5 mM, que proporciona resultados satisfactorios en la mayoría de los casos. Si un mayor Mg 2 + de concentración se requiere, hasta 3,5 l de 25 mM de MgCl 2 se puede añadir a una reacción. <ol start="2"><li> Mezclar bien la mezcla de reacción con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo, luego dispensar volúmenes adecuados en tubos de PCR. </li><li> Añadir template ADN a cada tubo de PCR. Recomendamos 10 ng de ADN genómico. </li><li> Programe el termociclador de acuerdo a la Tabla 2. Un mantenimiento final a 4 º C se recomienda para la conveniencia. Si está utilizando un termociclador sin tapa térmica, las reacciones de superposición con 100 l de aceite mineral. </li><li> Coloque los tubos de PCR en el termociclador e iniciar el programa de ciclismo. </li></ol> B. Vacío Protocolo de estación de trabajo La inmovilización de los productos de PCR biotinilados <ol><li> Hacer una mezcla maestra de acuerdo con la Figura 4. </li></ol> Nota: Antes de pipeteado, agitar suavemente la botella de perlas de Sepharose recubiertas con estreptavidina para asegurar una suspensión homogénea. <ol start="2"><li> Dependiendo del volumen de producto de PCR utilizado, dispensar 60-75 mezcla maestra l en cada pocillo de una placa de PCR para dar un volumen total de 80 l por pocillo. </li><li> Añadir 5-20 l producto de PCR biotinilado a cada pocillo. </li><li> Selle los pocillos con cinta caps y agitar la placa de PCR a 1400 rpm durante 5-10 minutos a temperatura ambiente (15-25 ° C) utilizando un agitador orbital. </li></ol> La desnaturalización de ADN y la adición de cebador de secuenciación <ol><li> Diluir los cebadores de secuenciación a 0,3 mM con tampón de reasociación y dispensar 25 l en cada pocillo de una placa de reacción. Coloque la placa en la estación de trabajo. </li><li> Llenar los comederos de estaciones de trabajo de acuerdo con el diagrama de la figura 5. </li><li> Encienda la bomba de vacío, y asegúrese de que el interruptor de la herramienta de vacío está activada (Figura 6). Enjuague la sonda de filtro con agua de alta pureza (Milli-Q 18,2 MW x cm o equivalente) en el canal 5 (Figura 5). Vuelva a llenar la cubeta con agua de alta pureza fresca para su uso en el paso 12. </li><li> Trabajando rápidamente, coloque la placa de PCR con los granos en la estación de trabajo. Asegúrese de que ambas placas están en la misma orientación que cuando se cargaron las muestras. </li><li> Con el interruptor de vacío conectado, reduzca el vacíoherramienta en los pocillos de la placa de PCR de 20 segundos o hasta que todo el volumen ha sido aspirado. Las perlas serán capturadas por la herramienta de vacío (Figura 7). </li><li> Con el vacío todavía en ON, la herramienta de enjuague con etanol al 70% (a través de 1) durante 20 segundos o hasta que todo el volumen ha sido aspirado. </li><li> Con vacío conectado, lave la herramienta con una solución de desnaturalización (canal 2) durante 20 segundos o hasta que el volumen se ha aspirado. </li></ol> Nota: La solución de desnaturalización contiene hidróxido de sodio, que es un irritante de la piel y los ojos. Siempre use una bata de laboratorio, guantes y gafas de protección. <ol start="8"><li> Con vacío conectado, lave la herramienta con tampón de lavado (cubeta 3) durante 20 segundos o hasta que el volumen se ha aspirado. </li><li> Con vacío conectado, levante la herramienta de vacío a más de 90 ° en vertical durante 5 segundos, para permitir que todo el líquido se escurra fuera de la herramienta de vacío. Apague la bomba y alinear la herramienta de vacío con la placa de reacción. Mueva la herramienta de vacío en elpozos y agitar suavemente de un lado a otro para liberar las perlas en el cebador de secuenciación que contiene pozos. </li><li> Con el fin de limpiar la herramienta de vacío, agitar las sondas de filtro en agua de alta pureza (canal 4) para 10 seg. </li><li> Encienda la aspiradora y limpiar la herramienta con agua de alta pureza (canal 5) durante 20 segundos o hasta que el volumen se ha aspirado. </li><li> Levante la herramienta de vacío más allá de 90 ° C vertical, durante 5 segundos, luego cambia el vacío OFF y almacenar en la posición de &quot;estacionamiento&quot;. </li></ol> Recocido cebador de secuenciación a hebras de ADN <ol><li> Coloque la placa de reacción en un soporte de la placa precalentada. </li><li> Calentar la placa en un bloque de calentamiento a 80 ° C durante 2 min. </li><li> Retire la placa del soporte y el lugar en el mostrador para enfriar a temperatura ambiente durante 5 min. </li></ol> PyroMark Q24 Operación Nota: Encienda el instrumento con el interruptor de alimentación situado por encima del cable de alimentación. Estrellatup puede tardar hasta 1 minuto. <ol><li> Rellenar un cartucho según las instrucciones proporcionadas en el PyroMark Oro Q24 Reactivos Manual 2. Para determinar los volúmenes necesarios, configurar un archivo de ejecutar en el software del aparato, y en el menú Herramientas, seleccione Información Run Pre </li><li> Si el instrumento ya estaba en marcha, asegurarse de que no se está realizando una carrera y luego abra la tapa. Una señal acústica se emite si la tapa se abre cuando no es seguro hacerlo. </li><li> Abra la puerta del cartucho e inserte el cartucho con la etiqueta hacia arriba (Figura 8). Asegúrese de que el cartucho se ha insertado correctamente (una línea debe ser visible en la parte delantera) y cierre la puerta. </li><li> Abra el marco de la placa de sujeción y la posición de la placa con las muestras en el interior del instrumento. </li><li> Cierre el marco de la placa de sujeción y la tapa del instrumento (Figura 9). </li></ol> Inicio de una carrera <ol><li> Inserte la memoria USB con el archivo de ejecucións creado con el software del instrumento en el puerto USB en la parte frontal del instrumento. </li><li> Seleccione &quot;Ejecutar&quot; en el menú principal y pulse el botón &quot;OK&quot;. </li><li> Utilice las flechas de desplazamiento para seleccionar el archivo de ejecución deseado y pulse &quot;Seleccionar&quot;. </li></ol> Nota: El instrumento comenzará a dispensar reactivos cuando se alcanzan toda la presión preestablecida y temperatura (esto puede tardar varios minutos). Durante una ejecución, la pantalla muestra el instrumento de pirograma el pozo seleccionado en tiempo real. Utilice las flechas de desplazamiento para ver el pirograma de otros pozos. Completar una carrera <ol><li> Cuando el instrumento confirma que ha terminado la carrera y el archivo de ejecución se ha guardado en la memoria USB, pulse el botón &quot;Cerrar&quot;. </li><li> Retire el dispositivo USB. Si se retira antes de que termine la carrera, inserte la memoria USB. Seleccione &quot;Administración&quot; y luego &quot;Copiar Runs no guardados&quot;. </li><li> El archivo de ejecutar ahora se puede abrir y se analizó usando el software del instrumento y se comparaa una biblioteca de microbios conocidos usando el software Identifire. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Qiagen. Autores Ahmed, Durocher, Jessen y Vardi son empleados de Qiagen Inc., que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

Varios de los nuevos métodos de secuenciación de nueva generación se han comercializado. Tres de los métodos más ampliamente utilizados son la secuenciación de iones de semiconductores, la secuenciación de una sola molécula en tiempo real, y la secuenciación por síntesis (SBS). 3-11 Cada uno de estos métodos depende de secuenciación por síntesis, pero emplean plataformas novedosos para la detección de los nucleótidos incorporados. En la secuenciación de semiconductores de iones, una sola hebra de ADN sirve como molde para la secuenciación de hebra. 12 polimerasa y los nucleótidos se añaden secuencialmente como en pirosecuenciación. Cuando se añade un nucleótido a la cadena de ADN creciente, se libera un ion de hidrógeno. El ion hidrógeno es detectado por un sensor basado en transistor de efecto de campo. Secuenciación en tiempo real molécula individual depende de la guía de ondas modo cero (ZMW). 13 El ZMW es una pequeña estructura en la que una sola molécula de polimerasa se ​​une a la parte inferior del pozo. Se ilumina de una manera tal que una floremolécula de olor puede ser detectado. Cada nucleótido está etiquetado con una molécula fluorescente. En cuanto se incorpora un nucleótido marcado con fluorescencia, detector identifica el nucleótido. Cuando se añade el siguiente nucleótido, la molécula fluorescente se escinde. 14 La secuenciación por síntesis (SBS) utiliza un método único para amplificar el ADN diana de tal manera que grupos de secuencias únicas se generan. 15 plantillas de cadena sencilla se generan y luego se sintetiza la hebra complementaria. Cada nucleótido está marcado con una molécula fluorescente y después de cada adición de base se registra la fluorescencia de la base añadida.

Pirosecuenciación es un método rápido y preciso para la secuencia de ácidos nucleicos que se basa en el principio de &quot;secuenciación por síntesis&quot;. &quot;La secuenciación por síntesis&quot; implica el uso de una sola hebra molde de ADN para sintetizar la cadena complementaria de una base a la vez, y la detección de la base incorporada (A, T, G o C) en cada paso por la detección de una señal quimioluminiscente. La reacción pirosecuenciación incluye ADN molde, los dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferina, luciferasa, y apirasa. La reacción de síntesis se inició mediante la adición de uno de los cuatro dNTPs y ADN polimerasa a la plantilla de ADN biotinilado de cadena sencilla. ADN polimerasa incorpora el dNTP complementario en la plantilla, con la posterior liberación de pirofosfato (Figura 1). ATP sulfurilasa convierte proporcionalmente el pirofosfato de ATP. ATP actúa como un catalizador para la conversión mediada por la luciferasa de la luciferina a oxiluciferina, la cualgenera luz (Figura 2). La intensidad de la luz es proporcional al número de nucleótidos incorporados y determina si está presente en la cadena molde de forma secuencial (Figura 3) uno o más de dNTP específica (dATP, dTTP, dGTP, dCTP o). Cualquier dNTP no incorporada se degrada por apirasa antes de la adición de la siguiente dNTP para la continuación de la reacción de síntesis. Este &quot;secuenciación por síntesis&quot; reacción se repitió con la adición de cada uno de los cuatro dNTPs hasta que se determine la secuencia de ADN de la plantilla de ADN de cadena única. Para ver una animación de la reacción pirosecuenciación <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> .

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

Pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano que se puede utilizar para identificar las especies bacterianas, discriminar las cepas bacterianas y detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los agentes anti-microbianos. Las ventajas de pirosecuenciación para aplicaciones de microbiología incluyen cribado de alto rendimiento rápido y fiable y precisa identificación de los microbios y las mutaciones del genoma microbianas. Pyrosequencing implica la secuenciación de ADN mediante la síntesis de la cadena complementaria de una sola base en un momento, mientras que la determinación del ser específica de nucleótidos incorporados durante la reacción de síntesis. La reacción se produce en inmovilizada plantilla de ADN de cadena sencilla en donde se añaden los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTP) secuencialmente y los dNTPs no incorporados se degrada enzimáticamente antes de la adición de la siguiente dNTP a la reacción de síntesis. Detección de la base específica incorporado a la plantilla se controla por la generación de chemilumseñales inescent. El orden de dNTPs que producen las señales quimioluminiscentes determina la secuencia de ADN de la plantilla. La capacidad de secuenciación en tiempo real de la tecnología de pirosecuenciación permite la rápida identificación microbiana en un único ensayo. Además, el instrumento pirosecuenciación, puede analizar la diversidad genética completa de la resistencia a los medicamentos anti-microbiana, incluida la tipificación de SNPs, mutaciones puntuales, inserciones y deleciones, así como la cuantificación de múltiples copias de genes que pueden producirse en un poco de resistencia antimicrobiana patrones.

Los resultados de una ejecución típica pirosecuenciación usando el software muestra la ubicación de los cebadores directo e inverso usados ​​para la generación de amplicón, y el cebador de secuenciación utilizado para la reacción pirosecuenciación dentro de la secuencia 16S ribosómica conservado (Figura 10). La secuencia hipervariable entre el cebador permite a los sitios para la identificación de bacterias de un gran número de especies bacterianas utilizando el cebador de secuenciación conservada (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Como un control de calidad interno, la secuencia de ADN horquillado la región variable puede ser comprobado para asegurar que la región de ADN correcta se ha analizado . El software de pirosecuenciación permite la comparación y la alineación de la secuencia generada a una base de datos interna de secuencias ribosómicas bacterianas para la identificación bacteriana. Además, una secuencia puede ser analizada para determinar las mutaciones que confieren resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, el análisis de mutaciones en los genes ribosómicos 23S de Helicobpylori rácter muestra dos patrones de mutación (GAA o AGA) que confieren resistencia a los antibióticos (Figura 11). Análisis de múltiples aislados de la misma paciente puede ser ensayada simultáneamente para realizar un seguimiento de la aparición de resistencia a los medicamentos en el tiempo para ayudar en las investigaciones epidemiológicas de brotes de resistencia a fármacos microbianos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Figura 1. Producto de PCR biotinilado se utiliza como una plantilla para incorporar dNTPs por la ADN polimerasa, lo que lleva a la generación de pirofosfato (PPi). <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Figura 2. ATP sulfurilasa convierte proporcionalmente pirofosfato de ATP. Actos ATP como un catalizador para la conversión mediada por la luciferasa de la luciferina a oxiluciferina, la cual genera luz que es Proproporcional a la cantidad de ATP. La luz se registra como máximo en la traza pirograma e indica la incorporación de nucleótidos. Los dNTPs no incorporados son degradados por apirasa antes de añadir el siguiente dNTP para la continuación de la síntesis. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Figura 3. La intensidad de la luz generada indica si se incorpora una o más de dNTP específica (dATP, dTTP, dGTP, dCTP o) sobre la cadena molde secuencialmente. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> La Figura 4. Diagrama de flujo para la preparación de la mezcla maestra para inmovilizar el producto de PCR biotinilado. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;always&quot;&gt; Figura 5. PyroMark estación de trabajo, con la placa de PCR, placa PyroMark y lugares mínimas. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> La Figura 6. Localización del interruptor de vacío posiciones ON y OFF. <img alt="La figura 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Figura 7. Herramienta de vacío. Manejo adecuado de la herramienta de vacío. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Figura 8. Abrió la puerta del cartucho con el cartucho en su lugar. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> La Figura 9. Cartucho insertado correctamente con la puerta cerrada. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> La Figura 10. Pyrosequencing resultados de la identificación de bacterias basados ​​en. Cebadores de la PCR están diseñados para regiones conservadas de la plantilla de ADN, y el cebador de secuenciación se coloca inmediatamente aguas arriba de la identificación de una secuencia de ADN hipervariable bien caracterizado en el amplicón (que se muestra en azul). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> La Figura 11. La detección de la resistencia a los antibióticos en Helicobacter pylori mediante pirosecuenciación. Análisis de mutaciones en los genes 23S que confieren resistencia antibacteriana en Helicobacter pylori contiene GAA o secuencias de AGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Componente </td><td> Volumen por reacción </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 l </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Concentrado CoralLoad, 10x </td><td> 2,5 l </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 (opcional) </td><td> Variable </td><td> ≥ 1,5 mM </td></tr><tr><td> Q-Solution, 5x (opcional) </td><td> 5 l </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / Primer B </td><td> Variable / Variable </td><td> 0.2 μM/0.2 mM </td></tr><tr><td> RNasa libre de agua </td><td> Variable </td><td> - </td></tr><tr><td> Volumen Total (después de añadir ADN molde) </td><td> 25 l </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Mezcla de reacción de PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Y nbsp; </td><td></td><td> Comentarios adicionales </td></tr><tr><td> Etapa de activación inicial de PCR </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq ADN polimerasa se activa </td></tr><tr><td> 3 etapa de ciclo: desnaturalización </td><td> 30 seg </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Recocido </td><td> 30 seg </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Para el ADN genómico Para bisulfito de ADN convertido </td></tr><tr><td> Extensión </td><td> 30 seg </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Número de ciclos </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La extensión final </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. Especificaciones del ciclo de PCR.

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Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano que se puede utilizar para identificar las especies bacterianas, discriminar las cepas bacterianas, y detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los agentes anti-microbianos. En este vídeo, se demostrará el procedimiento para la generación de amplicón microbiana, amplicón pirosecuenciación, y el análisis de secuencia de ADN.

Pyrosequencing para la identificación microbiana y caracterización

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

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Research

JoVE Journal

Biology

46.8K vistas.  Johns Hopkins University. Pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano que se puede utilizar para identificar las especies bacterianas, discriminar las cepas bacterianas, y detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los agentes anti-microbianos. En este vídeo, se demostrará el procedimiento para la generación de amplicón microbiana, amplicón pirosecuenciación, y el análisis de secuencia de ADN.

Video: Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Comunidades microbianas en la naturaleza y de laboratorio - Entrevista

Investigación

Biología

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biología de las comunidades microbianas - Entrevista

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Un método simple para determinar el genotipo exacto

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Planta promotor análisis: Identificación y caracterización del promotor de la raíz específica de nódulo en el frijol común

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as regulators of various biological processes. Notably, emerging evidence demonstrates that host circRNAs can be differentially expressed (DE) upon infection with&#160;pathogens (e.g., influenza and coronaviruses), suggesting a role for circRNAs in regulating host innate immune responses. However, investigations on the role of circRNAs during pathogenic infections are limited by the knowledge and skills required to carry out the necessary bioinformatic analysis to identify DE circRNAs from RNA sequencing (RNA-seq) data. Bioinformatics prediction and identification of circRNAs is crucial before any verification, and functional studies using costly and time-consuming wet-lab techniques. To solve this issue, a step-by-step protocol of in silico prediction and characterization of circRNAs using RNA-seq data is provided in this manuscript. The protocol can be divided into four steps: 1) Prediction and quantification of DE circRNAs via the CIRIquant pipeline; 2) Annotation via circBase and characterization of DE circRNAs; 3) CircRNA-miRNA interaction prediction through Circr pipeline; 4) functional enrichment analysis of circRNA parental genes using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). This pipeline will be useful in driving future in vitro and in vivo research to further unravel the role of circRNAs in host-pathogen interactions.

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

The protocol submitted here explains the complete in silico pipeline needed to predict and functionally characterize circRNAs from RNA-sequencing transcriptome data studying host-pathogen interactions.

In Silico Identificación y caracterización de circRNAs durante las interacciones huésped-patógeno

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...