Tüm yazarlar sunulan analizin kurulması ve doğrulama doğru ve yazının taslak katkıda bulunmuştur.

Protokoldeki tüm hayvan deneysel prosedürleri Technische Universität München, Almanya&#39;da hayvan bakım yönergeleri izleyin. 1.. Medya / Hazırlık Özü <ol><li> Doku homojenizasyon Doku homojenizasyonu kalitesi kültürlenmiş nöronlar içinde nöroplastik değişiklikler daha sonra tespit edilebilmesi için çok önemlidir. Burada, homojenleştirici doku sıcaklık önemli bir artış olmadan, doku ayrılmasını sağlayan önerilir. <ol><li> Aktarım 5 mm x 5 mm x 5 mm doğrudan doku homogenator bir katı fazda ve sıvı azot yerine -80 ° C ila pankreas dokusu küp. İdeal homogenator bu defreeze izin vermeden, yeterince hızlı doku ayırmak olacaktır. </li><li> Hemen ayrıldıktan sonra, 0,1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 300-500 ul katı, toz-benzeri Homojenat yeniden süspanse edin. İşte, bu nöronlar lyse olabilir çünkü (örneğin RIPA&#39;da gibi) herhangi bir lizis tampon kullanmayın.</li><li> Bench santrifüj (örneğin 21.130 xg) maksimum hızı en az 15 dakika boyunca homojenatlarına santrifüj. Doku özü temsil berrak süpernatant toplayın. </li></ol></li><li> Hücre hattı süpernatanlan <ol><li> Normal bir büyüme ortamı içinde% 80 izdiham -, ilgi konusu hücreler, en az 70 ulaşmak olsun. </li><li> Genellikle, bu medya serum bileşenlerini içeren ve nöronal büyüme üzerinde kontrol edilemeyen etkiler yapabilir. Bu nedenle, istenen hücre yoğunluğuna ulaştıktan sonra, hücre kültürü dereceli PBS ile en az 3 kere hücreleri yıkamak ve en fazla 48 saat boyunca serumsuz ortamda (SFM) yerleştirin. Not: Burada, (pankreas stellat hücreleri gibi) bazı hücreler normal durumunu ve yapısını korumak için kendi büyüme ortamı içinde serum gerekebilir düşünün. Bu gibi durumlarda, sağlam hücre functio için gerekli olası en düşük serum içeriği bulmak için ilgi hücrenin ortam içinde seri serum seyreltmeleri gerçekleştirmekn. </li><li> Bradford protein deneyi ile doku ya da hücre homojenatının süpernatantların protein konsantrasyonu ölçülür. Bu değerler, doku ve hücre tipine bağlı olarak farklı olsa da, pankreas doku özleri için, tek bir 5-12 mg / ml arasında bir konsantrasyon aralığı beklemek ve 3-8 ug / ul arasında hücre hattı için yüzer olacaktır. </li></ol></li></ol> 2.. Kısım özleri ve Hücre üst fazlan Deneyde kullanılması için konsantrasyona bağlı olarak, nöronal ortam içinde özü veya yüzer nihai konsantrasyonu, 100 ug / ml 5,8 olmalıdır. Not: nöronlar, 24 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna 500 ul ortam içinde büyüyen bir tahlil için, bir de başına her özü ya da süpernatanmdan proteinin 50 ug gerekmektedir. Yaklaşık 10 mg / ml bir konsantrasyonda, tipik özü, her bir oyuk için bir özü / yüzer 5 ul gerekir. Her setting, bir üç kopya olarak gerçekleştirilmiştir, bu özü / süpernatan 15 ul karşılık gelir. Farklı doku ya da hücre tipi için, son yüzer özü veya konsantrasyon seri seyreltileri yapmak ve farklı özü / yüzer konsantrasyonları arasında gözlenen nörotrofik etkilerinin karşılaştırılması. Nöronlar 3. İzolasyonu Extract / yüzer toplama bittiğinde, nöronların izolasyonu ile devam. <ol><li> DRG nöronlar için, doğum sonrası gün (P) 2-12 decapitation ve DRG stereomicroscopic diseksiyonu (Şekil 1A) sonra yenidoğan sıçanların DRG&#39;yi lomber servikal toplamak. , 24-delikli plaka için yeterli DRG nöronlarını sahip plaka başına (52 DRG eşit), bir yeni doğmuş sıçan DRG lomber tüm servikal toplamak için. <ol><li> Microscissors vasıtasıyla periferik (sinirsel) ve DRG merkezi projeksiyonlar (kök) kesip. Yerinde projeksiyonlar bırakmak öğütülmesinden engeller ve t artırırO fibroblastlar tarafından kültür riskini kontamine. </li></ol></li><li> MP nöronlar için, elle ince bağırsak ve gelen mezenteri kesip ve dikkatle ince bağırsak (MP izolasyon ayrıntılı bir protokol için, Schäfer ve diğ. 9 Şekil 1B bakınız) seromüsküler tabakası kapalı şerit. MP için, 24 kuyulu bir levha başına iki sıçan pleksus toplar. Not: ince bağırsaktan başarılı ayrılmasını engelleyen beri seromüsküler katmanında gözyaşları önlemek için mümkün olduğunca nazik olmaya çalışın. </li><li> Gentamisin (500ml bir ortam içinde 20 mg) ve metronidazol (500 ml ortam içinde 2.5 mg) ile birlikte buz soğukluğunda minimal esas ortamı içinde DRG ve seromüsküler tabaka (MEM) toplayın. </li><li> DRG toplanmasından sonra, 20-30 dakika boyunca kolajenaz Tip II ile birlikte Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde inkübe. MP izolasyonu için, yaşına bağlı olarak 1-3 saat arasında kollajenaz tip inkübehayvanın (Şekil 1C). </li><li> MP için, stereomicroscope altında net gibi MP parçalarını toplamak ve buz gibi soğuk MEM transfer. </li><li> Ardından çapı azalan şırınga yoluyla DRG ve MP çiğnemek. Not: Aşırı triture nöronları yok, ama daha az glia hücreleri olabilir. </li><li> DRG veya MP içeren ortam, 5 dakika boyunca 93.9 xg&#39;de bulutlu süspansiyon, santrifüj hale geldikten sonra, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 0.5 mM L-glutamin ile takviye edilmiş ortam içinde Neurobasal orta ve tekrar süspansiyon (atmak ve% 2 B-27). </li><li> Bir hemasitometre ile hücrelerin toplam sayısını (örneğin, nöronlar ve glia) sayılır. Not: gereken hücre sayısı ölçü parametresine bağlıdır. Nörit yoğunluğunun ölçümü için, bir nevrit dışa büyümesinin, perikaryonal boyutunun ölçülmesi için daha yoğun kültürleri ve böylece hücrelerin büyük bir sayıda ihtiyacıve bireysel nöronların desen dallanma. Nörit yoğunluk ölçümleri için, örneğin iyi 10,000 hücreleri (nöron + glia) / veya 1.500 nöronlar / iyi kullanın. Bireysel nöronlar, kısa (1 dakikalık uzun) hücrelerinin tripsinizasyon ve 2.500 hücre / kuyu veya 400 nöronlar / of ekimi üzerine morfometresi için de önerilir. Bir sıçandan alınan hücrelerin tipik bir verim yaklaşık 300.000-500.000 hücredir. </li><li> Gece önce kaplanmış 13 mm kapak hücreleri ve tohum (100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 0.5 mM L-glutamin ve% 2 B-27) Neurobasal ortamı (Şekil ile kuyu üst 1D). Not: Kullanım poli-D-lisin (40 mg / m 2) ya da ornitin ve laminin ile kaplanmış kaplama (1 mg / ml her biri) kapak slipleri. Hücreler bu nedenle birçok hücreler ihtiyaç olduğu deneylerde (yani akson yoğunluk ölçümleri) için uygun hale, son derece hızlı poli-D-lisin eklemek. Laminine Ek genel bazılarında olduğuNe zayıf ama laminin nevrit dışa büyümesinin güçlü bir promoterdir. Bu nedenle, dallanma nöronal ve nörit uzunluğu ölçümleri, ornitin / laminin-kaplama tercih ederim. </li><li> Hücreler, gece boyunca oyuklara takmak izin verin. Bir sonraki gün, (100 ug / ml &#39;lik bir son özü / yüzer madde konsantrasyonunda) ekstresi ile takviye edilmiş ortam hazırlar. </li><li> Tohumlama orta aspire ve PBS ile isteğe bağlı, çok nazik yıkama gerçekleştirmek, ve sonra yavaş yavaş extract / yüzer-desteklenmiş medya (Şekil 1E) pipetle. </li><li> Hücreler 48 saat için büyümeye izin verin. Medya aspire ve (Şekil 1F) immünboyama için% 4 paraformaldehid düzeltmek. </li><li> Nöron-spesifik (örneğin beta III-tubulin) ve glia-spesifik (örneğin, glial fibriallary asidik protein / GFAP) belirteçleri (Şekil 1G) kullanılarak çift immünofluoresans boyanma gerçekleştirin. </li><li> Morfometresi için, kombinasyon wi bir CCD kamera ile donatılmış bir ters ışık mikroskobu kullanınnörit yoğunluk ölçümünü sağlar otomatik yazılım (bkz. Tablo) inci. </li><li> Nöronal kültürlerin yoğunluğu, nevrit 50 um x 50 um ızgara uzanır ve bununla kesişen liflerin ölçülen kare başına lif yoğunluğu sayılarak her bir lamel üzerine yoğun büyüme 4 farklı bölgelerinden 200x büyütmede 4-5 Örnek fotomikrograflarında ölçülür. Nörit gelişimi, nöron başına düşen şube sayısı ortalaması, ortalama dal uzunluğu ve perikaryonal boyutu nevritlerle ve perikarya (Şekil 1H) işaretleyerek her lamel rastgele seçilen 30 yalnız nöronlardan ölçülebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması ve finansal açıklamaları var.

Mevcut protokol son zamanlarda PCa&#39;nın ve CP 5 nöroplastisitesi mekanizmaları incelemek için bizim grup tarafından geliştirilen in vitro pankreatik nöroplastisite tahlil arkasındaki metodoloji göstermek için tasarlanmıştır. Protokol sanatçı DRG ve MP nöronların izolasyonu ve kültürü yeterli deneyim kazanmıştır sonra kolayca uygulanabilir üç günlük bir prosedür içerir. Ayrıca, pankreas microenvironmental bileşenlere enterik ve DRG ilişkili glia birlikte reaksiyonu i...

Gastrointestinal (Gİ) sinir morfolojisi ve yoğunluğu değişiklikler uzun bir süre için gastroenterolog ve patologlar dikkatini çekti, ama GI hastalıkların patofizyolojisi için kendi alaka 1-3 bilinmemektedir. Gerçekte, bu tür gastrit, reflüks yemek borusu iltihabı, kolit, divertikülit ve apandisit gibi birkaç derece yaygın GI hastalıkları, iltihaplı doku alanlarında 1 &#39;de artan innervasyon yoğunluğuyla ilişkilidir. Ancak, gerçek bir ilgi kadar GI de mekanizmaları ve nöroplastisite anlamı ödenmiştir. Morfolojik değişmiş GI sinirler fonksiyon açısından, enterik sinir sisteminin normal devlet, yani normal bir GI sinirler farklı mı? Plastik enterik sinir değişmiş nöropeptid / nörotransmiter içeriği etkileri nelerdir? Periferik nöroplastisite her zaman merkezi sinir sistemi değişmiş sinyalizasyon gerektirmez mi? Ve nerede plastik kurtarmasına merkezi projeksiyonları vardırnsic GI sinir yolları? GI nöroplastisitesi fonksiyonel yönleri üzerinde bilgimizin azlığı bakarken gibi önemli soruların uzun bir dizi kolaylıkla oluşturulabilir. Fonksiyonel düzeyde GI nöroplastisitesi çalışma, geçerli tekrarlanabilir ve hala kolayca uygulanabilir deneysel modeller gerektiriyor. Artan bir dönemde popülerlik ve bu vivo ortamlarda GDO&#39;lu koşullu fare modelleri (GECoMM), kabulü gerçekçi bir şekilde 1 GI nöroplastisitesi önceden bilinmeyen yönleriyle aydınlatmak potansiyelini taşımaktadır. Ancak, GECoMM tasarım ve üretim, pahalı kalır emek-yoğun ve özellikle, zaman alıcıdır. Bundan başka, koşullu olarak genetik olarak değiştirilmiş fare (bağırsak epitel hücrelerinde sinir büyüme faktörü / NGF örneğin transgenik aşırı ekspresyonu) modüle edilecek hedefin önsel seçimi gerektirir. Bu nedenle, des içinBaşarılı bir GECoMM bir ign, araştırmacılar, bir değerli hedefin bazı göstergeler (örneğin önceki deneysel veri) gerekir (burada NGF) ilgilenilen molekül en az GI sinirler üzerinde bazı biyolojik ilgili etkiler yarattığı bekleniyor olabilir yani. Bu tip göstergeler kolayca in vivo sistemin karmaşık mikro-izole edilmiş hücre alt tipi seçici bir heterotipik şekilde 4-7 kültüre edilebilir in vitro modellerde yeterli türetilebilir. Bir heterotipik kültür ortamda moleküler hedeflerin modülasyonu, daha hızlı, daha az ortalama teknik zahmetlidir ve bu nedenle in vivo çalışmalarda doğrulanması için değerli hedeflerin ön süzme yardımcı olabilir. Son zamanlarda, intrapankreatik NE artan sinir yoğunluğu ve hipertrofisi taklit etmek için tasarlanmış bir in vitro deneyi nöroplastisite sunulmaktadırinsan pankreas kanseri (PCA) ve kronik pankreatit (CP) dokuları rves. Burada, yeni doğmuş fare dorsal kök ganglion (DRG) veya miyenterik pleksus (MP) türetilen nöronlar cerrahi olarak kesilmiş dokuları PCa ya da CP örneklerden doku özleri maruz kalmış ve normal insan pankreas (NP), doku ekstreleri 5 kültürlenmiş ile karşılaştırıldı. Bunun yerine, doku özleri, bir de nöroplastisitesi üzerine seçilen hücre türlerinin etkilerini incelemek için hücre hattı, üst fazlar kullanabilir. Standardize morfometrik ölçüm ile kombine edildiğinde, sunulan nöroplastisite tahlil farklı pankreas mikroçevrelerde yanıt nöronal plastisite geçerli ve tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar. Özel olarak, bu sağlayan nevrit dışa büyümesinin, desen ve nöronal dallanma boyutu, ve 2) fonksiyonel nöroplastisite, periferal sinir hücrelerinin uyarılabilirliğinin yani değişikler değişikliklerin, yani 1) morfolojik nöroplastisitesi simülasyon. Ayrıca, çevresel sadece (örn. </em&gt; Bağırsak) değil, aynı zamanda, merkezi (örn. DRG ya da ikinci derece spinal) nöronları farklı GI doku içeriğine morfolojik ve fonksiyonel reaksiyon değerlendirmek için, bu deneyde dahil edilebilir. Mevcut video ders, biz bu testin performans için teknik protokolünü göstermek ve avantajları ve zayıf yönlerini tartışmak. Ayrıca, herhangi bir GI organ nöroplastisitesi çalışmada bu testin temel kavramının uygulanabilirliğine dikkat çekmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

Nöroplastisite patolojik koşullar altında, enterik sinir sistemi ve gastrointestinal (GI) innervasyonunun içsel bir özelliğidir. Ancak, GI bozuklukları nöroplastisitesi patofizyolojik rolü bilinmemektedir. Simülasyon ve GI nöroplastisitesi modülasyonu sağlayan yeni deneysel modeller gibi pankreas kanseri (PCA) ve kronik pankreatit (CP) olarak özellikle GI hastalıkların nöroplastisitesi katkısının gelişmiş takdir sağlayabilir. Burada, yeni doğan sıçan dorsal kök ganglionlar (DRG) ve myenterik pleksusu (MP) nöronlar kullanılarak in vitro koşullarda pankreas nöroplastisitesi simülasyonu için bir protokol mevcut. Bu çift-nöron yaklaşım hem organ içsel ve dışsal-nöroplastisite izlenmesini sağlar, ama aynı zamanda nöronal ve glial morfolojisi ve elektrofizyoloji değerlendirmek için değerli bir araç temsil değil sadece. Dahası, onların IMPAC eğitim için verilen microenvironmental içeriklerin fonksiyonel modülasyonu sağlarnöroplastisitesi t. Bir kez kurulan, mevcut nöroplastisite tahlil herhangi GI organ nöroplastisitesi çalışmaya uygulanabilir olma potansiyelini taşımaktadır.

Morfolojik nöroplastisite Yeni doğmuş farelerin (P2-12) ile tohumlama yoğunluklarının belirtilen yaş aralığında, MP ve DRG nöronları daha önce 48 saat (Şekil 2A) sonra yoğun nöronal ağlar oluşturmak. PKa, CP yetiştirilmektedir nöronlar arasındaki nörit yoğunluğu ve NP özler karşılaştırması NP ekstrelerinde ya da daha PCa CP ekstrelerinde DRG nöronlarının nörit büyük yoğunluğa (Şekil 2A) 5 ortaya koym...

Watch this Scientific Journal Video about Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay at JoVE.com

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Nöronal plastisite gastrointestinal (Gİ) sistem giderek tanınan, fakat yeterince anlaşılır bir özelliktir. Burada, insan pankreas bozuklukların örnekte, morfolojik ve fonksiyonel hem düzeyinde GI nöronal plastisite çalışma için, bir in vitro deneyi nöroplastisite mevcut.

Pankreas Nöroplastisite benzetme:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-nöron Plastisitesi Deneyi

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

9.7K Görüntüleme.  Technische Universität München.  Nöronal plastisite gastrointestinal (Gİ) sistem giderek tanınan, fakat yeterince anlaşılır bir özelliktir. Burada, insan pankreas bozuklukların örnekte, morfolojik ve fonksiyonel hem düzeyinde GI nöronal plastisite çalışma için, bir in vitro deneyi nöroplastisite mevcut. 

Video: Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Tıp

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio based cues and set within the context of a video game metaphor, users gather relevant spatial information regarding a building's layout. This allows the user to develop an accurate spatial cognitive map of a large-scale three-dimensional space that can be manipulated for the purposes of a real indoor navigation task. After game play, participants are then assessed on their ability to navigate within the target physical building represented in the game. Preliminary results suggest that early blind users were able to acquire relevant information regarding the spatial layout of a previously unfamiliar building as indexed by their performance on a series of navigation tasks. These tasks included path finding through the virtual and physical building, as well as a series of drop off tasks. We find that the immersive and highly interactive nature of the AbES software appears to greatly engage the blind user to actively explore the virtual environment. Applications of this approach may extend to larger populations of visually impaired individuals.

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind.

Ses tabanlı Sanal Oyun Ortamı Geliştirilmesi Kör Navigasyon Becerileri ile Yrd etmek

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Post-lezyonlu Solunum nöroplastisite Eğitim için Servikal Spinal Kord Yaralanması bir fare modeli

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

İnsan Epileptik Ameliyat sonrası Kortikal Doku Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Prion Proteini Dönüştürme Deneyi

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

Uçtan uca anastomoz Robotik Merkezi Pancreatectomy içinde uygulanması

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

İntraportal fare modeli pankreas adacıkları nakli

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...