이 작품은 NIH 교부금 1R21NS064412, NSF 교부금 1,052,048 및 제프리스 기념 트러스트 부여 J-908에 의해 지원되었다.

1. 샘플 준비 주 : 많은 경우 관류 실험 초조 문제가 될 수있는 세포의 상당한 부분을 씻어 흘려. 폴리-L-라이신 모든 세포 라인, 코팅 커버 유리 표면에 (표면에 0.01 % 용액의 1.0 ml/25 cm 2를 추가 할 필요는 없습니다 만, 세포 배양 등급 물로 2 회 세척&gt; 5 분을 배양하고, 건조 생물 안전 캐비닛) 세포 접착을 향상시킵니다. 또한, 사용되는 세포주의 바이오 안전성 레벨 (BSL)을 인식하고, 지역의 환경 보건 및 안전 사무실에서 승인 한 표준 운영 절차를 따르십시오. 이 실험에서, COS7 세포 (도 4 참조)로 인해 낮은 내인성 글루타민 수송 활성에 사용 하였다. <ol><li> 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM) 70-80 % 년 자랄 + 10 % 우주의 혈청과 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 하나 6 자 문화에 배치 멸균 25mm 유리 커버 슬립에 ~에 씨 COS7 세포요리 또는 8 잘 유리 바닥 슬라이드. 37 ° C에서 5 % CO 2, 24 시간 동안 100 % 습도에서 품어. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라, DMEM +10 % 우주의 혈청 (항생제)에 성장 배지를 교환한다. 100 % 습도에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 O / N을 성장. </li><li> (CMV 프로모터 10에서 FLIPQTV3.0 센서를 수행 한 pcDNA3.1) 글루타민 센서와 10 ~ 50 ㎖의 혈청이없는 미디어 (OPTI-MEM) mCherry - 태그 ASCT2를 인코딩 0.4 mg의 플라스미드 DNA를 각각 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 50 ㎖의 혈청이없는 미디어로 형질 전환 시약 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 품어. </li><li> DNA (단계 1.3) 및 형질 전환 시약 (단계 1.4)를 포함하는 두 용액을 혼합하고 20 분 동안 품어. </li><li> 조심스럽게 세포의 상단에 형질 전환 시약을 추가하고 챔버를 흔들어 가볍게 섞는다. 37 ° C에서 5 % CO 2, 100 % 습도에서 24 시간 동안 배양한다. </li><li> 24 시간 후, DMEM + 10 %의 우주 송아지 세럼 매체를 교환페니실린 / 스트렙토 마이신 (CCS) + (100)는 유닛. </li><li> 세포는 48 ~ 72 시간 후 - 형질을 이미지하고 있습니다. </li></ol> 2. 관류 실험 주 :이 실험에서 사용 된 COS7 세포의 경우, 관류 매체와 챔버는 RT로 유지하고 주위 CO 2 농도 하였다. 사용되는 세포가 더 높은 온도와 CO 2 농도 제어 생존 가열 현미경 스테이지 및 / 또는 환경 챔버를 필요로하는 경우에는, 사용되어야한다. <ol><li> 관류 버퍼 AF를 준비 (재료의 목록을 참조하십시오.) , 50 ㎖ 주사기에 콕 마개를 부착 콕 마개를 닫고 다음 관류 솔루션을 입력합니다. 버퍼 크레인의 머리 공간을 채우기 위해 짧은 기간 동안 코크를 엽니 다. </li><li> 관류 연필로 8 채널, 중력 공급 관류 시스템에 전환 한 다음 선택 기능 옵션에서 &quot;수동 모드&quot;를 선택합니다. 재관류 연필에서 폐기물 용기를 놓습니다. </li><li> 수동으로대응하는 숫자를 눌러 포트를 활성화 및 물을 함유하는 10 ㎖ 주사기를 사용하여 호스를 기입하고 포트를 닫는다. 포트가 만수되면 관류 시스템의 포트 1-6에서 버퍼 AF를 함유하는 주사기를 설정하고 스톱 코크를 연다. 버퍼와 튜브에 물을 대체하기 위해 다시 포트를 엽니 다. 유속은 약 0.8 ㎖ / 분이어야한다. </li><li> 눌러 다시 &quot;기능 선택&quot;메뉴로 이동 관류 컨트롤러에 한 번 취소 할 수 있습니다. &quot;편집 프로그램&quot;옵션으로 전환 한 후 관류 프로토콜은 표 1에 입력합니다. 관류 프로그램을 저장합니다. </li><li> 인큐베이터 밖으로 세포를 가져 가라. 관류 버퍼로 두 번 세척 한 후 무대에서 세포를 설정합니다. 챔버에 관류 시스템을 연결합니다. 개방 챔버가 사용되는 경우, 챔버로부터 관류 액을 제거하는 또 다른 펌프를 설치했다. </li><li> Slidebook 소프트웨어를 엽니 다. 새 슬라이드를 시작합니다. 참고 :다음 절차는 Slidebook 소프트웨어에 고유 있지만, 이러한 MetaFluor 및 니스 요소로 다른 소프트웨어는 여기에 설명 된 영상의 종류에 사용할 수 있습니다. 이론적 실험 시간 코스 이미징을 허용하는 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수 있으며, 이미지 시퀀스는 ImageJ에 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) 또는 피지와 같은 소프트웨어를 사용하여 후 실험적으로 분석 할 수있다 (http:/ / fiji.sc / 피지). 그러나, 억 셉터 / 도너 비율의 실시간 모니터링을 허용 소프트웨어는 매우 유용하다. </li><li> 형광 현미경의 무대에 슬라이드를 장착합니다. 적절한 필터 세트를 사용하여 센서와 ASCT - mCherry 공동 발현하는 세포를 찾아 &quot;FOCUS&quot;기능에서 (재료의 목록을 참조하십시오). &quot;카메라&quot;탭을 클릭하고 &quot;이득&quot;에서 슬라이드 막대를 밀어 이득을 조정합니다. 또한, 감광 필터 드롭 다운 메뉴에서 감광 필터 설정을 조정합니다. 참고 : 필터 큐브 아이 필터를 포함하지 않는 경우, 간결시기 눈 조각을 사용하지 않는T 파장의 여기 광은 눈에 해 롭습니다. 대신 세포를 찾기 위해 컴퓨터 화면을 사용합니다. </li><li> 세포의 이미지를 얻기 with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (필터 재료의 목록에 명시되어있다). &quot;이미지 캡처&quot;를 클릭 한 다음 인수 창에서 사용하고자하는 필터를 지정합니다. 필터 설정 옆에있는 상자에 원하는 노출 시간을 입력하여 노출 시간을 조정하는 &quot;TEST&quot;버튼을 클릭합니다. 주 : 모든 세 개의 채널이 동일한 길이에 대해 노출 될 필요가있다. 촬상 파라미터를 조정하면, 예상 FRET 효율 변화를 가지고 고려 증가 겹 : FRET 효율 실험 중에 2 배 갈 것으로 예상되는 경우, 예를 들어, 영상 파라미터는 조정되어야해당 채널이 실험 기간 동안 포화 상태가되지 않도록 정지 상태에서 기증자 전 수락 엠의 강도는, &lt;악기에 의해 기록 될 수있는 최대 값의 50 % 들도록. 표지화 된 세포에서의 신호는 배경 영역에서보다 적어도 세 배 더 높아야한다. </li><li> 소프트웨어의 영역 도구를 사용하여 관심 영역을 그립니다. 대안 적으로, 특정 강도 이상 화소를 선택하는 소프트웨어 기능을 이용할 수 있고, 그 다음 영역으로 변환된다. 이렇게하려면 마스크를 클릭 - 세그먼트 다음 원하는 영역을 강조하는 슬라이드 막대를 이동합니다. </li><li> 캡처 형식 상자에서 &quot;시간 경과&quot;를 선택하고 간격 (이 실험에서는 10 초)하고 실험을위한 시간 지점을 지정합니다. </li><li> 모든 형광 세포없이 지역의 영역을 그립니다. 이 영역은 배경 빼기에 사용됩니다. 마우스 오른쪽 단추로 그린 영역을 클릭 한 다음 배경으로 설정합니다. 참고 : 더 있습니다 이상적으로, 세포를센서를 발현 t는 자기 형광 및 카메라에 의해 검출 배경 개화 모두 고려하여 배경 영역으로 사용되어야한다. 그러한 세포가 시야에 사용할 수없는 경우 세포가없는 적어도 영역은 배경 형광을 고려하여 사용되어야한다. </li><li> 옵션 - &quot;실행 프로그램 기능 선택&quot;에서 원하는 프로그램을 선택합니다. 저장된 프로그램 (단계 2.3 참조)로 전환 한 후 관류 컨트롤러에 입력하고 Enter 키를 누르십시오. 이제 프로그램이로드되고, 임의의 키를 타격하는 재관류를 시작합니다. </li><li> 관류를 확인하고 촬상 실험 관류 컨트롤러 키를 누르는 것과 동시에 캡쳐 윈도우에서 &quot;시작&quot;버튼을 클릭함으로써 동시에 시작한다. 참고 :이 솔루션은 (이것은 인수 탭 내에있는 &quot;주의 사항&quot;기능을 사용하여 수행 할 수 있습니다) 교환 된 평가시기를 기록하는 것이 좋습니다. </li><li> 같은 관류 프로토콜 USI를 수행실험 조건 하에서, 포화 또는 언 바운드가 될 것으로 예상된다 센서를 발현하는 세포를 겨. 참고 : 여기에, 실험 조건 하에서 포화 FLIPQTV3.0_1.5μ는, 제어, 그림 6과 같이 사용되는 이러한 제어 실험은 FRET 효율의 변화가없는 기판의 실제 변화에 기인하고 있음을 확인하기 위해 필요합니다. 때문에 이러한 세포의 pH와 같은 다른 매개 변수의 변화에​​. </li></ol> 3. 후 실험 분석 <ol><li> 샘플 드리프트는 실험 기간 동안 발생했는지 검사합니다. 관심 영역 (ROI)을 그립니다 평가시기 0에서 찍은 이미지들, 그 이미지 창의 상단에있는 슬라이드 막대를 이동하고 세포 실험에서 나중에 촬영 한 이미지의 ROI를 열외하는지 확인합니다. </li><li> 그렇다면, 다음 마스크를 선택하여 세포의 주위에 마스크를 만들고, 처음으로 드리프트를 보정하기 위해 추적 기능을 사용하는 경우 - 세그먼트를, 다음 HIG에 컷오프를 지정하는 라인을 밀어영역이 세포를 포함 hlight. 마스크를 클릭하여 영역을 추적 - 입자 추적 - 기본 입자 추적. </li><li> 필요한 경우 ROI를 다시 그릴과 배경 영역. </li><li> 실험의 과정을 통해 로아의 평균 강도를 보냅니다. 통계를 클릭합니다 - 수출 - 비율 / 인터벌 데이터. </li><li> 기질 농도의 FRET 효율과 정량화가 필요없는 경우, 기판의 역학의 프록시 강도 비 (기증자 전 수락 엠 / 기증 전 기증자 EM)의 시간 과정을 줄거리. 세포질 농도를 결정하기 위해, 최대 및 (각각 기판의 포화 및 부재에서, 즉,,) 최소한의 비율 변화, ΔR 최대 계산 - 다음과 같은 식에 Δratio (ΔR)의 비선형 회귀 분석에 의한 ΔR의 분 : ΔR = [S] / (K d 개 + [S]) × (ΔR <suB&gt; 최대 - ΔR 분) + ΔR 분 여기서 [S] 세포질에서 기질 농도이다. ΔR 최대 사용 - 주어진 ΔR에서 센서의 ΔR의 분 얻은 값, 채도 (S)는 다음과 같이 계산됩니다 S는 = (ΔR - ΔR 분) / (ΔR 최대 - ΔR 분) S는 또한 다음 식을 이용하여 기질 농도 [S]로 전환 될 수있다 : S = [S] / (K d 개 + [S]) 주 : 수락 전 수락 엠 채널의 강도도 실험 조건이 직접 수용체의 형광에 영향을 여부를 검사 그릴 수 있어야합니다. </li><li> 때문에 사진 표백에 대한베이스 라인 드리프트가 관찰 될 때,베이스 라인 보정을 수행합니다. 이렇게하려면, 시간이 지남에 따라 기증자와 수용체의 농도 (그림 5A)을 플롯. 그런 번째 사용 timepoints 식별E 기준선, 관류 시스템 지연과 특정 셀 (도 5b)의 전송 활동에 따라. </li><li> 최고의 기준을 설명하는 다항식 피팅을 계산합니다. 그런 다음,베이스 라인 (그림 5C)로 각각 평가시기에서 원시 강도를 정상화. 정규화 된 기증자와 수용체 강도에서 강도 비 (기증자 전 수락 엠 / 기증 전 기증자 EM)을 계산합니다. </li></ol>

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	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

공개 아무것도 없다.

영상 실험의 성공은 몇 가지 중요한 요소에 따라 달라집니다. 이러한 요인 중 하나는 전술 한 바와 같이, 사용 된 센서의 궁합이다. 또한 세포 내 구획에서 기판의 절대 농도는, 그러나, 종종 알려지지 않았다. 그러므로 우리는 원하는 실험 조건에 따라 가장 적합한을 찾을 수 있도록 지그재그 친화 여러 센서를 시도하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 우리의 경우에 우리는 1.5μ 함께 글루타민 센서를 ...

때문에 세포 수준에서의 전 사체와 단백체의 검사를 할 수 있습니다 기술의 놀라운 발전으로, 지금은 생화학 및 대사 물질과 이온의 결과 유출이 높은 셀 타입의 특정 분명되고있다. 예를 들어, 포유 동물의 간장에 순차 글루타민 분해 및 합성 후자 1-3에 과량의 암모니아를 소비하면서 전 셀 분류 우레아주기 암모늄 수유 각각 문맥 주위 세포와 perivenous 세포에 의해 동시에 수행된다. 일부의 경우, 상당한 이질성 생화학 심지어 단일 &quot;셀 분류&quot;4, 5에서 검출된다. 이러한 공간적 특이성 이외에, 대사 물질 및 이온의 세포 수준 (예 : 칼슘 2 + 및시 클릭 뉴클레오티드 같은 신호 분자, 예) 매우 동적이다. 대사와 이온의 시공간 패턴은 종종 신호 전달에 중요한 역할을한다. 엠대사와 이온의 세포 역학을 onitoring 그러나, 독특한 도전을 제기. 많은 경우에있어서 농도 변화는 빠른 과도 같은 돌기 쪽이 6 ~ 20 밀리 초 내에 소멸 칼슘 2 +와 같은 신호 전달 분자의 경우에 의해 예시된다. 또한, 세포 내와 사이 생화학 적 경로의 구획화 어려운 추출 및 컬럼 크로마토 그래피 / 질량 분석 기술을 이용하여 대사 물질 및 이온의 역학을 정량화 할 수있다. 생물학적 분자 유전자 인코딩 된 센서가 널리 인해 실험이 단명 및 / 또는 구획 된 분자 역학 연구 할 수있는 높은 시공간 해상도로 사용됩니다 (7에서 검토를, 8). 이들 유전자에 의해 코딩 센서는 크게 2 종류로 나눌 수있다; 강도 기반 센서 및 센서 ratiometic. 강도 기반 센서는 일반적으로 결합 도메인과 독감으로 구성orescent 단백질 (FPS) 및 결합 도메인에 결합하는 용질은 형광 강도를 변경합니다. Ratiometic 센서는 반면에, 종종 FRET 쌍으로서 기능이 FPS 사이 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 활용. 이러한 센서는 결합 도메인과 두 FPS로 구성하고, 바인딩 용질이 FPS 간의 FRET 효율의 변화를 유도한다. 생물학적으로 중요한 대사 물질 및 이온 용 센서의 다수는 지난 십 (8, 9)에서 개발되었다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 센서들에 의해 제공되는 흥미로운 가능성 중 하나는 이전에 세포 수준에서 검출하기 쉽지 않았다 막 수송 과정의 고해상도 분석에서의 사용이다. 유전자에 의해 코딩 센서는 기질 특이성하여 pH 의존성 (10, 11) 등의 반송기구의 분석을 용이하게한다. 또한, 유전 입술과 함께의 RNAi 라이브러리 모델 생물에 대한 생성 ources 같은, 그것은 유전자에 의해 코딩 센서를 사용하여 새로운 전송 프로세스에 대한 게놈 전체 검색을 수행 할 수있게되었습니다. 실제로, 다수의 경우 12, 13 이전에 uncharacterized 수송의 발견에 유전자 인코딩 센서 리드의 사용. 최근에, 우리의 실험실은 글루타민 FRET 기반 센서의 시리즈를 개발했습니다. 우리는 셀룰러 글루타민 농도는 FRET 글루타민 센서 (10)를 이용하여 가시화 될 수 있다는 것을 증명하고있다. 이 센서는 glnH의 C-말단 (그림 1)에서 세균 글루타민 결합 단백질 glnH에 삽입 된 FRET 기증자 (mTFP1) 및 FRET 수용체 (금성)으로 구성되어 있습니다. 이들 센서의 FRET 효율성 셉터 / 도너 강도 비의 감소의 결과로, 글루타민의 결합시 감소. 글루타민 전송 프로세스의 미세 조정은 neurotransm 같은 생물 학적 과정에 중요ission (14), (15) 및 간 1, 16, 17의 우레아주기의 유지. 여기서 우리는 광 시야 형광 현미경 셋업을 사용하여, 글루타민 FRET 센서로 전송 활동을 분석하는 방법을 보여준다. 여기에 도시 된 실험의 목표는 하나의 셀에 수송 활동을 검출하고 일시적으로 발현 트랜스 포터의 기질 특이성을 검토한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 생물학적 분자와 같은 센서의 엄청난 다양성은 많은 실험실에서 일상적으로 사용되는 필수 도구가 된 일부는, 지난 15 년 동안 사용 가능하게되었다. 유전자에 의해 코딩 센서 흥미로운 애플리케이션 중 하나는 셀룰러 전송 프로세스를 조사하고 이러한 센서의 사용이다. 이러한 반응 속도 및 기판 특이성 등의 수송의 속성 수송 활동의 세포 타입 별 분석에 대한 가능성을 제공하는 세포 수준에서 조사 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 수송 역학 예를 들어 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서를 사용하여 관찰 할 수있는 방법을 보여줍니다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석에 대한 고려 사항이 논의 될 것이다.

전형적인 시간 코스 실험 그림 2에 표시됩니다.이 실험에서, 8 개 mm (FLIPQTV3.0_8m, 그림 2A와 2B) 및 100 μM (FlipQTV3.0_100 μ C 및 D)의 친화력과 글루타민 센서를 FRET와 공동으로 표현했다 COS7 세포 (10)의 필수 아미노산 교환기 ASCT2 18. 글루타민의 유입은 도너 (mTFP1) 및 억 셉터 (금성) (도 2A 및 2C) 간의 형광 강도 비의 변화로서 검출된다. 다?...

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

이 문서에서는 FRET을 이용하여 살아있는 세포에서 글루타민의 역학을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석을위한 고려 사항은 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서에 대해 설명한다.

유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K 조회수.  Virginia Tech.  이 문서에서는 FRET을 이용하여 살아있는 세포에서 글루타민의 역학을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석을위한 고려 사항은 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서에 대해 설명한다. 

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

연구

생체공학

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

저렴한 센서와 곤충 검출 및 분류 플라잉

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

유 전적으로 변형 된 세포 이식을위한 미세 패턴 배양 플레이트에 회전 타원체 세포를 향해 유전자 형질

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

대화형, 환자 전용 모델을 사용 하 여 깊은 두뇌 자극 치료를 위한 신경 섬유 책자를 대상으로

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Methods Article

유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상