この作品は、NIHの助成金1R21NS064412、NSFの助成金1052048とJeffressメモリアル·トラスト助成金、J-908でサポートされていました。

1。サンプルの調製注：多くの場合、灌流実験はイライラ問題になることができ、細胞の大部分を、洗い流す。ポリ-L-リジンを有する全ての細胞株、被覆カバーガラス表面のために（表面への0.01％溶液の1.0 ml/25 cm 2の投稿必要はないが、細胞培養グレードの水で2回洗浄し、&gt; 5分間インキュベートし、乾燥生物学的安全キャビネット）は、細胞接着を増強する。また、使用される細胞株のバイオセーフティレベル（BSL）を認識して、地域の環境、安全衛生事務所によって承認標準作業手順に従ってください。この実験では、COS7細胞（ 図4参照）が低いため、内因性グルタミン輸送活性を用いた。 <ol><li>ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で70〜80％コンフルエント+ 10％宇宙胎児血清および100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、いずれか6ウェル培養中に入れ、無菌25mmのガラスカバースリップ上に〜をシードCOS7細胞皿または8ウェルガラス底スライドする。 37°C、5％CO 2、24時間、100％湿度でインキュベートする。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、DMEM +10％宇宙胎児血清（抗生物質なし）に成長培地を交換する。湿度100％で37℃、5％CO 2でO / Nを成長させる。 </li><li> （CMVプロモーター10の下FLIPQTV3.0センサーを運ぶのpcDNA3.1）グルタミンセンサーと10〜50ミリリットルの無血清培地（OPTI-MEM）mCherryタグ付きASCT2をコードする0.4 mgのプラスミドDNAのそれぞれを追加し、穏やかに混合する。 </li><li> 50ミリリットルの無血清培地へのトランスフェクション試薬の1ミリリットルを追加します。室温で5分間インキュベートする。 </li><li> DNA（ステップ1.3）およびトランスフェクション試薬（工程1.4）を含む二つの溶液を混合し、20分間インキュベートする。 </li><li>静かに、細胞の上にトランスフェクション試薬を追加し、チャンバーロッキングにより穏やかに混合します。 37°C、5％CO 2、湿度100％で24時間インキュベートする。 </li><li> 24時間後、DMEM +10 10パーセントコズミック胎児血清にメディアを交換する（CCS）ペニシリン/ストレプトマイシン+ 100単位。 </li><li>細胞は、48〜72時間後にトランスフェクションをイメージしている。 </li></ol> 2。灌流実験注：この実験で使用したCOS7細胞は、灌流媒体およびRTチャンバは、周囲CO 2濃度に維持した。使用される細胞は生存のために、より高い温度およびCO 2濃度の制御を必要とする場合は、加熱した顕微鏡ステージおよび/ ​​または環境チャンバを使用すべきである。 <ol><li>灌流液のAF（材料のリストを参照してください）​​を準備します。灌流液でそれらを埋めるし、ストップコックを閉じ、50ミリリットルの注射器にコックを取り付けます。バッファーでストップコック内のヘッドスペースを埋めるために短時間のストップコックを開きます。 </li><li>灌流鉛筆で8チャンネル、重力送り灌流システムの電源を入れ、[選択]機能オプションの下に「マニュアルモード」を選択します。灌流鉛筆の下に廃棄用容器を置きます。 </li><li>手動で対応する番号を押して、ポートをアクティブにして、水を入れた10ミリリットルの注射器を使用してチューブを埋め、その後、ポートを閉じる。ポートが水で満たされると、灌流システムのポート1-6にバッファAFを含有する注射器を設定し、コックを開きます。バッファを備えたチューブ内の水を交換し、再びポートを開く。流量は約0.8ミリリットル/分である必要があります。 </li><li>を押して戻って「選択機能」メニューに移動し、灌流コントローラを一度解除してください。 表1に示した灌流プロトコルで入力し、 &quot;編集プログラム」のオプションに切り替えます。灌流プログラムを保存します。 </li><li>インキュベーターから細胞を取る。灌流緩衝液で2回洗い、その後、ステージ上のセルを設定します。チャンバーに灌​​流システムを接続します。開放室を使用する場合は、チャンバーからの灌流液を除去し、別のポンプを設置した。 </li><li> Slidebookソフトウェアを起動します。新しいスライドを開始します。 注意：次の手順は、Slidebookソフトウェアに固有であるが、MetaFluor及びニシュ-要素のような他のソフトウェアはまた、ここに記載の撮像のタイプのために使用することができる。理論的実験は、時間経過イメージングを可能にする任意のソフトウェアを用いて行うことができ、画像シーケンスは、ImageJの（http://rsbweb.nih.gov/ij/）又はフィジーなどのソフトウェアを使用してポスト実験的に分析することができる（http:/ / fiji.sc /フィジー）。しかしながら、アクセプター/ドナー比率のリアルタイムモニタリングを可能にするソフトウェアは非常に有用である。 </li><li>蛍光顕微鏡のステージ上にスライドをマウントします。適切なフィルターセットを用いたセンサとASCT-mCherryを共発現する細胞を見つける「フォーカス」機能の下で（材料のリストを参照してください）​​。 「カメラ」タブをクリックし、「利得」の下のスライドバーをスライドさせてゲインを調整します。また、減光フィルタのドロップダウンメニューから減光フィルタの設定を調整します。注：フィルターキューブが目のフィルタが含まれていない場合は、ショアから接眼レンズを使用しないでくださいT-波長の励起光は、目に有害である。代わりに、細胞を見つけるために、コンピュータの画面を使用します。 </li><li>細胞の画像を取得with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels （フィルタは材料のリストで指定されています）。 「イメージキャプチャ」をクリックし、[取得]ウィンドウで、使用する予定のフィルタを指定。次のフィルタ設定にあるボックスに所望の露光時間を入力することで、露光時間を調整するために「TEST」ボタンをクリックしてください。注：すべての3つのチャネルが同じ長さのために露出される必要がある。撮像パラメータを調整するとき、予想されるFRET効率の変化を取ると考慮倍増加：FRET効率は、実験中に2倍に上がることが予想される場合など、撮影パラメータを調整すべきであるように、休止状態でのドナー· アクセプターエクスビボ実施の強度は、&lt;チャネルが実験中に飽和しないように、機器によって記録することができる最大値の50％であるべきである。標識された細胞からのシグナルは、バックグラウンド領域におけるよりも少なくとも3倍高くなければならない。 </li><li>ソフトウェアにおける領域ツールを使用して関心領域を描画します。あるいは、特定の強度の上方に画素を選択するためのソフトウェア機能を使用して、[領域に変換することができる。これを行うには、マスクをクリックします - セグメントは、所望の領域を強調表示するスライドバーを移動します。 </li><li>キャプチャの種類]ボックスで「時間の経過」を選択して、実験のための間隔（本実験では10秒）の時点を指定します。 </li><li>任意の蛍光細胞なしエリア内の領域を描画します。この領域は、バックグラウンド減算のために使用される。右描かれた領域をクリックして、背景として設定します。注：ある理想的には、細胞をセンサーを発現tは自家蛍光かつカメラによって検出された背景蛍光の両方を考慮して、背景領域として使用されるべきである。そのような細胞は、視野内に使用できない場合、細胞を含まない領域は、少なくともバックグラウンド蛍光を説明するために使用されるべきである。 </li><li>オプション - &quot;を実行したプログラム機能を選択」の下で目的のプログラムを選択します。保存されたプログラム（ステップ2.3を参照）に切り替え、その後、灌流コントローラ上でエンターキーを押します。今すぐプログラムがロードされ、いずれかのキーを打つと、灌流を開始します。 </li><li>灌流コントローラのキーを押すと同時にキャプチャウィンドウで「スタート」ボタンをクリックすることで、同時に灌流およびイメージング実験開始を確認してください。 注意：これは、溶液が（これは買収タブ内にある「注意」機能を使用して行うことができます）交換された時点を記録することをお勧めします。 </li><li>同じ灌流プロトコルUSIを行う実験条件の下で、飽和または非連結のどちらかであることが期待されているセンサーを発現する細胞をngの。 注：ここでは、実験条件の下で飽和するFLIPQTV3.0_1.5μは、制御は図6のように使用されるような制御実験は、FRET効率の変化ではなく、基板の実際の変化によるものであるとことを確認する必要がある。セルラpHなどの他のパラメータの変化による。 </li></ol> 3。ポスト実験解析<ol><li>サンプルドリフトが実験中に発生したかどうか調べます。画像ウィンドウの上部にあるスライドバーを移動し、細胞は、実験の後半で撮影した画像にROIの外に落ちるかどうかを確認して、関心領域（ROI）は時点0で撮影された画像のS描画します。 </li><li>はい、マスクを選択することで、セルの周囲にマスクを作成、最初でドリフトを補正するためにトラッキング機能を使用する場合 - セグメントを、その後HIGにカットオフを指定する行をスライド細胞を含有する領域をhlight。粒子追跡 - - 基本粒子追跡マスクをクリックして領域を追跡します。 </li><li>必要なときにROIを再描画し、背景領域。 </li><li>実験の過程でのROIの平均強度をエクスポートします。エクスポート - - レシオ/タイムラプスデータ統計をクリックします。 </li><li>基質濃度のFRET効率および定量化を必要としない場合は、基板のダイナミクスのプロキシとして強度比（ ドナー· アクセプター元全角 /ドナー生体ドナー全角 ）の経時変化をプロットする。 、細胞質ゾル濃度を測定最大（それぞれの基板の飽和および不存在下で、すなわち 、）最小比率変更、Δrの最大を計算するには-をΔr 分 、次式Δratio（ΔR）の非線形回帰によって： ΔR= [S] /（ のK D + [S]）×（ΔR <suB&gt;マックス- Δrの分 ）+ΔR 分 ここで、[S]細胞質ゾル中の基質濃度である。 Δrはマックスを使用した-得Δrの最小値が、与えられた量Δrにおけるセンサの彩度（S）は次のように計算されます S =（ΔR - Δrの分 ）/（ΔR マックス - Δrの分 ） Sは、さらに、以下の式を用いて基質濃度[S]に変換することができる。 S = [S] /（ のK D + [S]） 注意： アクセプタEXアクセプターEMチャネルの強度も、実験条件は、直接アクセプターの蛍光に影響を与えたかどうかを調べるためにプロットされるべきである。 </li><li>時による光退色ベースラインドリフトは、ベースライン補正を行い、観察される。これを行うには、時間をかけて（ 図5A）をドナーとアクセプターの強度をプロットします。そして、目に使用する時点を特定するEベースライン、灌流システムでの遅延と、特定のセル（ 図5B）の輸送活性に応じた。 </li><li>最高のベースラインを記述する多項式フィッティングを計算します。その後、ベースライン（ 図5C）に各時点からの生強度を正規化する。正規化されたドナーとアクセプターの強度から強度比（ ドナーEX·アクセプター·EM、/ドナーEXドナーEM）を計算します。 </li></ol>

<ol>
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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

開示することは何もありません。

イメージング実験の成功は、いくつかの重要な要因に依存します。これらの要因の一つは、上述したように、使用されるセンサの親和性である。関心対象の細胞内区画中の基質の絶対濃度は、しかしながら、多くの場合不明である。そこで我々は、目的の実験条件の下で最適なものを見つけるために千鳥親和性を有する複数のセンサを試してみることをお勧め。例えば、我々の場合、我々は1...

により細胞レベルでのトランスクリプトームやプロテオームの検査を可能にする技術の目覚しい進歩により、現在では、生化学および代謝物とイオンの結果としてフラックスは非常に細胞型特異的であることが明らかになってきた。例えば、哺乳動物の肝臓において、シーケンシャルグルタミン分解及び合成は、後者1-3で過剰のアンモニアを消費しながら、前者の細胞型において尿素サイクルにアンモニアを供給し、それぞれ門脈周囲細胞および静脈周囲の細胞によって同時に行われる。いくつかの場合において、重要な生化学的異質性は、単一の「細胞型」4,5で検出される。このような空間的な特異性に加えて、代謝産物およびイオンの細胞レベル（ 例えば、例えばCa 2 +および環状ヌクレオチドなどのシグナル伝達分子）は非常に動的である。代謝産物およびイオンの時空間パターンは、多くの場合、シグナル伝達に重要な役割を果たす。 M代謝物やイオンの細胞動態をonitoringしかし、ユニークな課題をもたらす。多くの場合、濃度の変化は、迅速かつ一過性の、例えば、樹状突起棘6〜20ミリ秒以内に減衰のCa 2 +のようなシグナル伝達分子の場合が例示される。さらに、細胞内および間の生化学的経路の区画化が困難抽出およびカラムクロマトグラフィー/質量分析技術を用いて代謝産物およびイオンのダイナミクスを定量化することができる。 生物学的分子のための遺伝的にコードされたセンサーは、現在広くにより実験者が（7、8に概説されている）短命および/ ​​または区画化された分子動力学を研究することを可能にする、高時空間解像度に使用されている。これらの遺伝的にコードされたセンサーは、大きく2つのカテゴリに分けることができ;強度ベースのセンサとratiometicセンサー。強度ベースのセンサは、通常、結合ドメインやインフルエンザで構成されてorescentタンパク質（FPS）、および結合ドメインに結合する溶質は、蛍光強度が変化します。 Ratiometicセンサは、一方で、多くの場合、FRETペアとして機能する2つのFPとの間のフォスター共鳴エネルギー移動（FRET）を利用する。これらのセンサは、結合ドメイン二つのFPからなり、溶質の結合は、2つのFPとの間のFRET効率の変化を誘導する。生物学的に重要な代謝産物およびイオンのための多数のセンサは、過去10年間8,9開発されている。 そのような遺伝的にコードされたセンサによって提供される刺激的な可能性の一つは、以前に、細胞レベルで検出することは容易ではなかった膜輸送プロセスの高分解能分析におけるそれらの使用である。遺伝的にコードされたセンサは、基質特異性およびpH依存10,11等の搬送機構の分析を容易にする。また、遺伝的RESとの組み合わせでRNAiのライブラリがモデル生物のために構築ourcesこのように、それは遺伝的にコードされたセンサーを用いた新規輸送プロセスのためのゲノムワイドな検索を行うことができるようになりました。実際、複数のケースで以前に特徴づけられていない輸送体の発見に遺伝的にコード化されたセンサリードの使用12、13。 最近、私たちの研究室では、グルタミンのためのFRETに基づくセンサーのシリーズを開発しました。我々は、細胞のグルタミンレベルが例えばFRETグルタミンセンサ10を用いて可視化することができることを実証した。これらのセンサは、glnHのC末端（ 図1）での細菌グルタミン結合タンパク質glnHに挿入されたFRETドナー（mTFP1）、およびFRETアクセプター（ヴィーナス）から構成されています。これらのセンサのFRET効率は、アクセプター/ドナー強度比の減少をもたらす、グルタミンの結合時に減少する。グルタミン輸送プロセスの微調整は、例えばneurotransmなどの生物学的プロセスにおいて重要であるission 14,15および肝臓1、16、17における尿素サイクルの維持。 ここでは、広視野蛍光顕微鏡セットアップを使用して、グルタミンFRETセンサーを輸送活性を分析する方法論を示す。ここに示された実験の目的は、単一の細胞においてトランスポーター活性を検出し、一過性に発現トランスポーターの基質特異性を検討することである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。生物学的分子のためのようなセンサの驚異的な様々な多くの研究室で日常的に使用される不可欠なツールとなったそのうちのいくつかは、過去15年で利用可能となりました。 遺伝的にコードされたセンサの刺激的な用途の一つは、細胞輸送プロセスを調査において、これらのセンサの使用である。そのような動態および基質特異性などの輸送体の特性は、輸送活性の細胞型特異的な分析の可能性を提供し、細胞レベルで調べることができる。この記事では、トランスポーターのダイナミクスは、一例として、遺伝的にコードされグルタミンセンサーを使用して観察することができる方法を紹介します。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が議論される。

典型的な時間経過実験を、図2に示されている。これらの実験では、8 mMの（FLIPQTV3.0_8m、 図2Aおよび2B）および100μM（FlipQTV3.0_100μC及びD）の親和性グルタミンセンサーFRETと共発現させたCOS7細胞10における必須のアミノ酸交換ASCT2 18。グルタミンの流入は、ドナー（mTFP1）およびアクセプター（金星）（ 図2Aおよび2C）</strong...

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

この記事では、FRETを使用して、生細胞内のグルタミンダイナミクスを監視する方法を紹介します。遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が遺伝的にコードされたグルタミンセンサに議論される。

遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K ビュー.  Virginia Tech. この記事では、FRETを使用して、生細胞内のグルタミンダイナミクスを監視する方法を紹介します。遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が遺伝的にコードされたグルタミンセンサに議論される。 

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

生物工学

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

安価なセンサで昆虫の検出と分類をフライング

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

遺伝的に改変された細胞移植のためのマイクロパターン培養プレート上スフェロイド細胞に対する遺伝子導入

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

遺伝的にコードされたFRETベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

頭蓋骨の重要な骨欠損修復の多光子顕微鏡In Vivo遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場による血管新生を可視化

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

CRISPR/Cas9 複合体の前核注入による遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの生産

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

対話型、患者固有のモデルを用いた脳深部刺激療法の神経繊維の管を対象と

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...