وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 1R21NS064412، ومنحة جبهة الخلاص الوطني 1052048 وJeffress التذكارية تراست منحة J-908.

1. إعداد نموذج ملاحظة: في كثير من الحالات التجارب نضح يغسل جزءا كبيرا من الخلايا، التي يمكن أن تصبح مسألة محبطة. على الرغم من أن ليس من الضروري لجميع خطوط الخلايا، الواجهات الزجاجية غطاء طلاء مع بولي-L-يسين (إضافة 1.0 سم 2 ml/25 من الحل 0.01٪ إلى السطح، واحتضان&gt; 5 دقائق، ويغسل مرتين مع المياه خلية ثقافة الصف، وجاف في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية) يعزز التصاق الخلية. أيضا، يكون على بينة من مستوى السلامة الأحيائية (BSL) من خط الخلية المستخدمة، واتباع إجراءات التشغيل القياسية المعتمدة من قبل مكتب الصحة والسلامة البيئية المحلية. في هذه التجربة، واستخدمت خلايا cos7 بسبب انخفاض نشاط النقل الجلوتامين الذاتية (انظر الشكل 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا cos7 البذور في ~ 70-80٪ confluency في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ مصل العجل الكونية و 100 U / مل البنسلين / الستربتوميسين، إما على العقيمة coverslips الزجاج 25 ملم وضعت في ثقافة 6 جيداطبق أو 8 جيدا الشرائح الزجاجية القاع. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، و 100٪ الرطوبة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل المتوسطة النمو DMEM +10٪ مصل العجل الكونية (أي المضادات الحيوية)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في 100٪ الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 ملغ كل من الحمض النووي البلازميد ترميز أجهزة الاستشعار الجلوتامين (pcDNA3.1، تحمل أجهزة الاستشعار FLIPQTV3.0 تحت CMV المروج 10) وASCT2 mCherry الموسومة 10-50 مل مصل خالية سائل الإعلام (OPTI-MEM) والمزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من كاشف ترنسفكأيشن إلى 50 مل وسائل الإعلام الحرة المصل. احتضان عند RT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من الحلين التي تحتوي على الحمض النووي (الخطوة 1.3) وكاشف ترنسفكأيشن (الخطوة 1.4)، واحتضان لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إضافة كاشف ترنسفكأيشن على الجزء العلوي من الخلايا والمزيج بلطف بواسطة هزاز الغرفة. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، و 100٪ الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، تبادل المتوسط ​​إلى DMEM + 10٪ مصل العجل الكونية(CCS) + 100 وحدة من البنسلين / الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تصوير الخلايا 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. </li></ol> 2. التجربة الإرواء ملاحظة: للحصول على خلايا cos7 المستخدمة في هذه التجربة، تم الاحتفاظ بها وسائل الإعلام ونضح غرفة على RT والمحيط CO 2 التركيز. ومع ذلك، إذا كانت الخلايا المستخدمة تتطلب أعلى درجات الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 تركيز الرقابة من أجل البقاء، ساخنة المرحلة المجهر و / أو غرفة البيئية التي ينبغي استخدامها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نضح عازلة AF (انظر قائمة المواد). نعلق الصمامات إلى 50 مل المحاقن، وإغلاق الصمامات ثم ملئها الحلول نضح. فتح محبس لفترة وجيزة لملء مساحة الرأس في محبس مع المخزن المؤقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على 8 قنوات، والجاذبية تغذية نظام الارواء مع قلم رصاص التروية، ثم حدد &quot;وضع دليل&quot; تحت تحديد الخيار وظيفة. وضع حاوية النفايات تحت قلم نضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدوياتفعيل الموانئ عن طريق الضغط على الأرقام المقابلة وملء الأنابيب باستخدام 10 مل حقنة تحتوي على الماء، ومن ثم إغلاق المنفذ. مرة واحدة تمتلئ الموانئ مع الماء، وتعيين الحقن التي تحتوي على مخازن AF على المنفذ 1-6 من نظام التروية، ومن ثم فتح الصمامات. فتح المنافذ مرة أخرى لتحل محل المياه في الأنابيب مع المخازن المؤقتة. وينبغي أن يكون معدل تدفق حوالي 0.8 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصحافة بإلغاء مرة واحدة على وحدة تحكم نضح العودة إلى القائمة &quot;تحديد دالة&quot;. تبديل إلى &quot;تحرير برنامج&quot; خيار، ثم اكتب في بروتوكول أشار نضح في الجدول 1. حفظ البرنامج الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ الخلايا من الحاضنة. يغسل مرتين مع العازلة التروية، ثم قم بتعيين الخلايا على المسرح. ربط نظام نضح إلى غرفة. إذا تم استخدام غرفة مفتوحة، وإنشاء مضخة أخرى أن يزيل الحل نضح من الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج Slidebook. بدء شريحة جديدة. ملاحظة:الإجراء التالي هو محددة لبرنامج Slidebook، ولكن يمكن أيضا برامج أخرى مثل MetaFluor ونيس، العنصر استخدامها لنوع من التصوير وصفها هنا. نظريا التجارب لا يمكن أن يؤديها استخدام أي من البرامج التي تتيح التصوير الوقت بالطبع، وتسلسلات الصور يمكن تحليلها بعد تجريبيا باستخدام برنامج مثل يماغيج (http://rsbweb.nih.gov/ij/) أو فيجي (http:// على / fiji.sc / فيجي). ومع ذلك، والبرمجيات التي تسمح للرصد في الوقت الحقيقي من نسبة متقبل / المانحة مفيد للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشريحة على خشبة المسرح المجهر الفلورسنت. العثور على خلايا المشترك، معربا عن أجهزة الاستشعار وASCT-mCherry باستخدام مجموعات التصفية المناسب (انظر قائمة المواد) تحت وظيفة &quot;FOCUS&quot;. ضبط مكاسب بالنقر على &quot;كاميرا&quot; التبويب وانزلاق شريط الانزلاق تحت عنوان &quot;مكاسب&quot;. أيضا، وضبط الإعداد مرشح كثافة محايدة من محايد مرشح الكثافة القائمة المنسدلة. ملاحظة: إذا لم المكعب التصفية تشمل عامل تصفية العين، لا تستخدم قطعة العين منذ الشورتي الطول الموجي ضوء الإثارة هو ضار للعيون. استخدام شاشة الكمبيوتر للعثور على الخلايا بدلا من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور من الخلايا with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (يتم تحديد المرشحات في قائمة المواد). انقر فوق &quot;التقاط صورة&quot;، ثم في إطار اقتناء وتحديد المرشحات التي سوف يتم استخدامها. انقر فوق الزر &quot;اختبار&quot; لضبط الوقت التعرض عن طريق كتابة وقت التعرض المطلوب في المربع بجانب إعدادات التصفية. ملاحظة: جميع القنوات الثلاث بحاجة إلى أن يتعرض لنفس الطول. عند ضبط المعلمات التصوير، واتخاذ الحنق التغيير الكفاءة المتوقعة وأضعاف زيادة في الاعتبار: على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع كفاءة الحنق لترتفع 2 أضعاف خلال التجربة، ينبغي تعديل المعلمات التصويرلذا يجب أن تكون شدة م القابل السابقين المانحة في حالة الراحة &lt;50٪ من القيمة القصوى التي يمكن تسجيلها من قبل الصك، حتى لا تصبح هذه القناة المشبعة أثناء التجربة. وينبغي أن يكون إشارة من الخلايا المسمى على الأقل أعلى ثلاث مرات من تلك التي في المنطقة الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنطقة ذات الاهتمام باستخدام أداة المناطق في البرنامج. بدلا من ذلك، وهي وظيفة البرنامج لتحديد بكسل أعلاه كثافة معينة يمكن استخدامها، ومن ثم تحويلها إلى المناطق. للقيام بذلك، انقر فوق قناع - الجزء، ثم حرك شريط انزلاق لتسليط الضوء على المناطق المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;الفاصل الزمني&quot; في مربع نوع إمساك، ثم حدد الفاصل الزمني (10 ثانية في هذه التجربة) والنقاط الزمنية للتجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنطقة في منطقة دون أية خلايا الفلورسنت. ويستخدم هذا المجال لطرح الخلفية. الحق فوق منطقة تعادل ومن ثم تعيينها كخلفية. ملاحظة: من الناحية المثالية، الخلايا التي توجدر معربا عن أجهزة استشعار يجب أن تستخدم المنطقة الخلفية لحساب كل من تألق ذاتي والإزهار خلفية الكشف عنها بواسطة الكاميرا. إذا لم تتوافر مثل هذه الخلايا في مجال الرأي، على الأقل في المنطقة دون الخلايا ينبغي أن تستخدم لحساب مضان الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد البرنامج المطلوب تحت عنوان &quot;اختر وظيفة - برامج تشغيل&quot; الخيار. تبديل لبرنامج حفظ (راجع الخطوة 2.3)، ثم ضرب على وحدة تحكم ENTER الارواء. الآن يتم تحميل البرنامج، وسوف تصل إلى أي مفتاح بدء الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان نضح وتجربة التصوير يبدأ في نفس الوقت عن طريق النقر على زر &quot;ابدأ&quot; في التقاط نافذة في نفس الوقت الضغط على مفتاح على وحدة تحكم الارواء. ملاحظة: من المستحسن لتسجيل timepoint حيث تم تبادل الحلول (وهذا يمكن أن يتم ذلك باستخدام &quot;ملاحظات&quot; وظيفة، وجدت ضمن علامة التبويب الاستحواذ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء نضح نفس البروتوكول باليودنانوغرام الخلايا معربا عن جهاز استشعار أنه من المتوقع أن تكون إما مشبعة أو غير منضم تحت شرط التجريبية. ملاحظة: هنا، FLIPQTV3.0_1.5μ، الذي المشبعة تحت حالة تجريبية، ويستخدم كعنصر تحكم، الشكل 6 هذه التجارب السيطرة ضرورية لتأكيد أن هذا هو بسبب التغير الفعلي في الركيزة التغيير الكفاءة والحنق لا. بسبب التغير في العوامل الأخرى مثل درجة الحموضة الخلوية. </li></ol> 3. تحليل ما بعد التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص عينة إذا حدث الانجراف أثناء التجربة. رسم المناطق ذات الاهتمام (ROI) ليالي على الصورة التي اتخذت في timepoint 0، ثم حرك شريط انزلاق في الجزء العلوي من النافذة التصوير ومعرفة ما اذا كان الخلايا تسقط من رويس في الصور التي التقطت في وقت لاحق في التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الإجابة بنعم، ثم استخدم وظيفة تتبع لتصحيح الانحراف من جانب أول، وخلق أقنعة حول الخلايا عن طريق تحديد قناع - الجزء، ثم حرك الخط الذي يحدد لقطع HIGhlight المناطق التي تحتوي على الخلايا. تتبع المناطق بالضغط قناع - تتبع الجسيمات - تتبع الجسيمات الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة رسم رويس والمنطقة الخلفية عند الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير كثافة متوسط ​​رويس على مدى التجربة. انقر الاحصائيات - تصدير - البيانات / نسبة timelapse. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الكفاءة الحنق والكمي لتركيز الركيزة ليست ضرورية، رسم مدار الساعة من نسبة كثافة (بحكم المانحة م والقابل، / م السابقين المانحة المانحة) كوكيل لديناميات الركيزة. لتحديد تركيز عصاري خلوي، وحساب الحد الأقصى والحد الأدنى من التغيير النسبة (أي في تشبع وغياب الركيزة، على التوالي)، Δr ماكس - Δr دقيقة، من خلال الانحدار غير الخطية من Δratio (Δr) مع المعادلة التالية: Δr = [S] / (K + د [S]) × (Δr <suب&gt; ماكس - Δr دقيقة) + Δr دقيقة حيث [S] هو تركيز الركيزة في العصارة الخلوية. ويتم احتساب القيم Δr دقيقة تم الحصول عليها، والتشبع (S) من أجهزة الاستشعار في Δr على النحو - باستخدام Δr ماكس S = (Δr - Δr دقيقة) / (Δr ماكس - دقيقة Δr) S يمكن تحويلها إلى مزيد من تركيز الركيزة [S] باستخدام المعادلة التالية: S = [S] / (K + د [S]) ملاحظة: يجب أن تكون كثافة القابل السابقين القابل قناة م تآمر أيضا لفحص ما إذا كانت حالة تجريبية أثرت في مضان من متقبل مباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما لوحظ الانجراف خط الأساس بسبب الصورة تبيض، إجراء تصحيح خط الأساس. للقيام بذلك، رسم شدة المانحة ومتقبل على مر الزمن (الشكل 5A). ثم تحديد timepoints المستخدمة في اله الأساسية، وفقا للتأخير في نظام الارواء ونشاط النقل معينة الخلية (الشكل 5B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المناسب polynominal التي تصف أفضل خط الأساس. ثم، وتطبيع كثافة الخام من كل timepoint إلى خط الأساس (الشكل 5C). حساب نسبة كثافة (بحكم المانحة م والقابل، / م السابقين المانحة المانحة) من شدة المانحة ومتقبل تطبيع. </li></ol>

<ol>
	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

نجاح تجارب التصوير يعتمد على عدد قليل من العوامل الهامة. واحد من هذه العوامل هو تقارب من أجهزة الاستشعار المستخدمة، كما نوقش أعلاه. التركيز المطلق من الركيزة في مقصورة التحت خلوية من الفائدة، ومع ذلك، غالبا ما يكون غير معروف. لذا نوصي تحاول أجهزة استشعار متعددة متداخ...

بسبب التقدم الملحوظ في التقنيات التي تتيح فحص Transcriptome على وبروتيوم على المستوى الخلوي، فقد أصبح من الواضح الآن أن الكيمياء الحيوية والتدفق الناتج من المركبات والأيونات هي غاية خلية من نوع معين. على سبيل المثال، في الكبد الثدييات، تتم تدهور الجلوتامين متتابعة والتوليف في وقت واحد من قبل خلايا والخلايا حول الأوعية البابية محيط بالوريد على التوالي، والتغذية الأمونيوم لدورة اليوريا في نوع من الخلايا السابقة في حين تستهلك الأمونيا الزائدة في الأخير 1-3. في بعض الحالات، تم الكشف عن عدم التجانس البيوكيميائية كبيرة حتى في واحد &quot;نوع من الخلايا&quot; 4، 5. بالإضافة إلى مثل هذه النوعية المكانية، ومستويات الأيض الخلوية والأيونات هي ديناميكية للغاية (على سبيل المثال، يشير الجزيئات مثل كا 2 + والنيوكليوتيدات الحلقية). الأنماط الزمانية المكانية من المركبات والأيونات غالبا ما تلعب أدوارا حاسمة في نقل الإشارة. Monitoring ديناميات الخلوية من المركبات والأيونات، ومع ذلك، تشكل تحديا فريدا من نوعه. في كثير من الحالات التغير في تركيزات هي سريعة وعابرة، والتي تجسدت في حالة إشارة الجزيئات مثل كا 2 +، والذي يضمحل داخل ~ 20 ميللي ثانية في العمود الفقري شجيري 6. بالإضافة إلى ذلك، تجزئة المسارات البيوكيميائية داخل وبين خلايا يجعل من الصعب تحديد ديناميات الأيضية والأيونات باستخدام استخراج والعمود اللوني / تقنيات قياس الطيف الكتلي. وتستخدم الآن على نطاق واسع أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا للجزيئات البيولوجية نظرا لدقة الزمانية المكانية العالية التي يسمح للمجرب لدراسة الديناميات الجزيئية قصيرة الأجل و / أو مجزأة (مراجعة في 7 و 8). يمكن تقريبا أن تقسم هذه المجسات المشفرة وراثيا إلى فئتين؛ أجهزة الاستشعار القائم على كثافة وأجهزة الاستشعار ratiometic. تتكون أجهزة الاستشعار القائم على كثافة عادة من مجال ملزمة والانفلونزاorescent البروتين (FPS)، والمذاب ملزم إلى المجال ملزمة بتغيير شدة الفلورسنت. أجهزة الاستشعار Ratiometic، من ناحية أخرى، وغالبا ما تستفيد من نقل الطاقة الرنين فوستر (الحنق) بين اثنين من ضباط التي تعمل كزوج الحنق. تتكون هذه المجسات من مجال ملزمة واثنين من ضباط، والمذاب ملزم الحث على التغيير في الكفاءة الحنق بين ضباط اثنين. وقد تم تطوير عدد كبير من أجهزة الاستشعار لنواتج الأيض المهمة بيولوجيا والأيونات في العقد الماضي 8، 9. واحدة من إمكانية إثارة مثل أجهزة الاستشعار التي تقدمها المشفرة وراثيا هو استخدامها في تحليل عالية الدقة من عمليات النقل الغشاء، التي كانت في السابق ليس من السهل للكشف على المستوى الخلوي. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا تسهيل تحليل آليات النقل مثل الركيزة خصوصية ودرجة الحموضة الاعتماد 10، 11. علاوة على ذلك، في تركيبة مع الدقة الوراثيةources مثل مكتبة رني يبني للكائنات النموذج، أصبح من الممكن الآن لإجراء عمليات تفتيش على نطاق الجينوم لعمليات النقل باستخدام أجهزة استشعار الرواية المرمزة وراثيا. في الواقع، واستخدام المشفرة وراثيا الرصاص استشعار لاكتشاف نقل uncharacterized سابقا في حالات متعددة 12 و 13. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت مختبرنا سلسلة من أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق لالجلوتامين. لقد أثبتنا أن مستويات الجلوتامين الخلوية يمكن تصور استخدام مثل أجهزة الاستشعار الحنق الجلوتامين 10. تتكون هذه المجسات من المانحين الحنق (mTFP1) إدراجها في البروتين البكتيري الجلوتامين ملزمة glnH، ومتقبل الحنق (فينوس) في C-تيرميني من glnH (الشكل 1). الحنق كفاءة هذه المجسات على خفض ملزم من الجلوتامين، مما أدى إلى انخفاض نسبة كثافة متقبل / المانحة. تنظيم عمليات النقل غرامة الجلوتامين مهم في العمليات البيولوجية مثل neurotransmission 14 و 15 و الحفاظ على دورة اليوريا في الكبد 1، 16، 17. نحن هنا تظهر منهجية تحليل أنشطة النقل مع أجهزة الاستشعار عن الحنق الجلوتامين، وذلك باستخدام المجهر مضان واسعة المجال انشاء. الهدف من التجارب المعروضة هنا هي للكشف عن أنشطة نقل في خلية واحدة ودراسة الركيزة خصوصية لنقل أعرب عابر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. أصبحت مجموعة متنوعة هائلة من مثل أجهزة الاستشعار عن الجزيئات البيولوجية المتاحة في السنوات ال 15 الماضية، وأصبح بعض من الأدوات التي لا غنى عنها التي يتم استخدامها بشكل روتيني في العديد من المختبرات. واحدة من التطبيقات المثيرة من أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا هو استخدام هذه المجسات في التحقيق في عمليات النقل الخلوية. خصائص نقل مثل حركية والخصوصيات الركيزة يمكن التحقيق على المستوى الخلوي، وتوفير الإمكانيات لتحليلات محددة من أنشطة النقل خلية من نوع. في هذه المقالة، سوف نظهر كيف يمكن ملاحظة ديناميات نقل باستخدام ترميز وراثيا استشعار الجلوتامين كمثال على ذلك. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية سيتم مناقشتها.

يتم تمثيل نموذجي التجارب الوقت بالطبع في الشكل 2. في هذه التجارب، وأجهزة الاستشعار الحنق الجلوتامين مع الانتماءات من 8 ملي (FLIPQTV3.0_8m، الشكل 2A و 2B) و 100 ميكرومتر (FlipQTV3.0_100 μ C و D) والتعاون مع أعربت واجبة مبادل الأحماض الأمينية في خلايا ASCT2 18 ...

Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

هذه المادة سوف تظهر كيفية رصد ديناميات الجلوتامين في الخلايا الحية باستخدام الحنق. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية وسوف تناقش لأجهزة الاستشعار الجلوتامين المشفرة وراثيا.

الجلوتامين الجريان التصوير باستخدام مجسات مشفرة وراثيا

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Views.  Virginia Tech.  هذه المادة سوف تظهر كيفية رصد ديناميات الجلوتامين في الخلايا الحية باستخدام الحنق. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريب...

Video: Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

تحلق كشف وتصنيف الحشرات مع مجسات رخيصة

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

الجينات ترنسفكأيشن نحو خلايا كروي على لوحات Micropatterned الثقافة لالمعدلة وراثيا زرع الخلايا

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

انتقائية القضاء خلية من الثقافة 3D المختلطة باستخدام تقنية الأشعة تحت الحمراء بالقرب من Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

رصد في الوقت الحقيقي من بين الخلايا الصفراء حمض حيوية باستخدام حمض الصفراء الاستشعار القائمة على الحنق ترميز وراثيا

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

إنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا عن طريق الحقن برونوكلير من مجمع كريسبر/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

استهداف مساحات الألياف العصبية للعلاج تحفيز الدماغ العميق باستخدام نماذج تفاعلية، والخاصة بالمريض

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...