وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 1R21NS064412، ومنحة جبهة الخلاص الوطني 1052048 وJeffress التذكارية تراست منحة J-908.

1. إعداد نموذج ملاحظة: في كثير من الحالات التجارب نضح يغسل جزءا كبيرا من الخلايا، التي يمكن أن تصبح مسألة محبطة. على الرغم من أن ليس من الضروري لجميع خطوط الخلايا، الواجهات الزجاجية غطاء طلاء مع بولي-L-يسين (إضافة 1.0 سم 2 ml/25 من الحل 0.01٪ إلى السطح، واحتضان&gt; 5 دقائق، ويغسل مرتين مع المياه خلية ثقافة الصف، وجاف في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية) يعزز التصاق الخلية. أيضا، يكون على بينة من مستوى السلامة الأحيائية (BSL) من خط الخلية المستخدمة، واتباع إجراءات التشغيل القياسية المعتمدة من قبل مكتب الصحة والسلامة البيئية المحلية. في هذه التجربة، واستخدمت خلايا cos7 بسبب انخفاض نشاط النقل الجلوتامين الذاتية (انظر الشكل 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا cos7 البذور في ~ 70-80٪ confluency في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ مصل العجل الكونية و 100 U / مل البنسلين / الستربتوميسين، إما على العقيمة coverslips الزجاج 25 ملم وضعت في ثقافة 6 جيداطبق أو 8 جيدا الشرائح الزجاجية القاع. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، و 100٪ الرطوبة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل المتوسطة النمو DMEM +10٪ مصل العجل الكونية (أي المضادات الحيوية)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في 100٪ الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 ملغ كل من الحمض النووي البلازميد ترميز أجهزة الاستشعار الجلوتامين (pcDNA3.1، تحمل أجهزة الاستشعار FLIPQTV3.0 تحت CMV المروج 10) وASCT2 mCherry الموسومة 10-50 مل مصل خالية سائل الإعلام (OPTI-MEM) والمزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من كاشف ترنسفكأيشن إلى 50 مل وسائل الإعلام الحرة المصل. احتضان عند RT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من الحلين التي تحتوي على الحمض النووي (الخطوة 1.3) وكاشف ترنسفكأيشن (الخطوة 1.4)، واحتضان لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إضافة كاشف ترنسفكأيشن على الجزء العلوي من الخلايا والمزيج بلطف بواسطة هزاز الغرفة. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، و 100٪ الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، تبادل المتوسط ​​إلى DMEM + 10٪ مصل العجل الكونية(CCS) + 100 وحدة من البنسلين / الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تصوير الخلايا 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. </li></ol> 2. التجربة الإرواء ملاحظة: للحصول على خلايا cos7 المستخدمة في هذه التجربة، تم الاحتفاظ بها وسائل الإعلام ونضح غرفة على RT والمحيط CO 2 التركيز. ومع ذلك، إذا كانت الخلايا المستخدمة تتطلب أعلى درجات الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 تركيز الرقابة من أجل البقاء، ساخنة المرحلة المجهر و / أو غرفة البيئية التي ينبغي استخدامها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نضح عازلة AF (انظر قائمة المواد). نعلق الصمامات إلى 50 مل المحاقن، وإغلاق الصمامات ثم ملئها الحلول نضح. فتح محبس لفترة وجيزة لملء مساحة الرأس في محبس مع المخزن المؤقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على 8 قنوات، والجاذبية تغذية نظام الارواء مع قلم رصاص التروية، ثم حدد &quot;وضع دليل&quot; تحت تحديد الخيار وظيفة. وضع حاوية النفايات تحت قلم نضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدوياتفعيل الموانئ عن طريق الضغط على الأرقام المقابلة وملء الأنابيب باستخدام 10 مل حقنة تحتوي على الماء، ومن ثم إغلاق المنفذ. مرة واحدة تمتلئ الموانئ مع الماء، وتعيين الحقن التي تحتوي على مخازن AF على المنفذ 1-6 من نظام التروية، ومن ثم فتح الصمامات. فتح المنافذ مرة أخرى لتحل محل المياه في الأنابيب مع المخازن المؤقتة. وينبغي أن يكون معدل تدفق حوالي 0.8 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصحافة بإلغاء مرة واحدة على وحدة تحكم نضح العودة إلى القائمة &quot;تحديد دالة&quot;. تبديل إلى &quot;تحرير برنامج&quot; خيار، ثم اكتب في بروتوكول أشار نضح في الجدول 1. حفظ البرنامج الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ الخلايا من الحاضنة. يغسل مرتين مع العازلة التروية، ثم قم بتعيين الخلايا على المسرح. ربط نظام نضح إلى غرفة. إذا تم استخدام غرفة مفتوحة، وإنشاء مضخة أخرى أن يزيل الحل نضح من الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج Slidebook. بدء شريحة جديدة. ملاحظة:الإجراء التالي هو محددة لبرنامج Slidebook، ولكن يمكن أيضا برامج أخرى مثل MetaFluor ونيس، العنصر استخدامها لنوع من التصوير وصفها هنا. نظريا التجارب لا يمكن أن يؤديها استخدام أي من البرامج التي تتيح التصوير الوقت بالطبع، وتسلسلات الصور يمكن تحليلها بعد تجريبيا باستخدام برنامج مثل يماغيج (http://rsbweb.nih.gov/ij/) أو فيجي (http:// على / fiji.sc / فيجي). ومع ذلك، والبرمجيات التي تسمح للرصد في الوقت الحقيقي من نسبة متقبل / المانحة مفيد للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشريحة على خشبة المسرح المجهر الفلورسنت. العثور على خلايا المشترك، معربا عن أجهزة الاستشعار وASCT-mCherry باستخدام مجموعات التصفية المناسب (انظر قائمة المواد) تحت وظيفة &quot;FOCUS&quot;. ضبط مكاسب بالنقر على &quot;كاميرا&quot; التبويب وانزلاق شريط الانزلاق تحت عنوان &quot;مكاسب&quot;. أيضا، وضبط الإعداد مرشح كثافة محايدة من محايد مرشح الكثافة القائمة المنسدلة. ملاحظة: إذا لم المكعب التصفية تشمل عامل تصفية العين، لا تستخدم قطعة العين منذ الشورتي الطول الموجي ضوء الإثارة هو ضار للعيون. استخدام شاشة الكمبيوتر للعثور على الخلايا بدلا من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور من الخلايا with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (يتم تحديد المرشحات في قائمة المواد). انقر فوق &quot;التقاط صورة&quot;، ثم في إطار اقتناء وتحديد المرشحات التي سوف يتم استخدامها. انقر فوق الزر &quot;اختبار&quot; لضبط الوقت التعرض عن طريق كتابة وقت التعرض المطلوب في المربع بجانب إعدادات التصفية. ملاحظة: جميع القنوات الثلاث بحاجة إلى أن يتعرض لنفس الطول. عند ضبط المعلمات التصوير، واتخاذ الحنق التغيير الكفاءة المتوقعة وأضعاف زيادة في الاعتبار: على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع كفاءة الحنق لترتفع 2 أضعاف خلال التجربة، ينبغي تعديل المعلمات التصويرلذا يجب أن تكون شدة م القابل السابقين المانحة في حالة الراحة &lt;50٪ من القيمة القصوى التي يمكن تسجيلها من قبل الصك، حتى لا تصبح هذه القناة المشبعة أثناء التجربة. وينبغي أن يكون إشارة من الخلايا المسمى على الأقل أعلى ثلاث مرات من تلك التي في المنطقة الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنطقة ذات الاهتمام باستخدام أداة المناطق في البرنامج. بدلا من ذلك، وهي وظيفة البرنامج لتحديد بكسل أعلاه كثافة معينة يمكن استخدامها، ومن ثم تحويلها إلى المناطق. للقيام بذلك، انقر فوق قناع - الجزء، ثم حرك شريط انزلاق لتسليط الضوء على المناطق المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;الفاصل الزمني&quot; في مربع نوع إمساك، ثم حدد الفاصل الزمني (10 ثانية في هذه التجربة) والنقاط الزمنية للتجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنطقة في منطقة دون أية خلايا الفلورسنت. ويستخدم هذا المجال لطرح الخلفية. الحق فوق منطقة تعادل ومن ثم تعيينها كخلفية. ملاحظة: من الناحية المثالية، الخلايا التي توجدر معربا عن أجهزة استشعار يجب أن تستخدم المنطقة الخلفية لحساب كل من تألق ذاتي والإزهار خلفية الكشف عنها بواسطة الكاميرا. إذا لم تتوافر مثل هذه الخلايا في مجال الرأي، على الأقل في المنطقة دون الخلايا ينبغي أن تستخدم لحساب مضان الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد البرنامج المطلوب تحت عنوان &quot;اختر وظيفة - برامج تشغيل&quot; الخيار. تبديل لبرنامج حفظ (راجع الخطوة 2.3)، ثم ضرب على وحدة تحكم ENTER الارواء. الآن يتم تحميل البرنامج، وسوف تصل إلى أي مفتاح بدء الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان نضح وتجربة التصوير يبدأ في نفس الوقت عن طريق النقر على زر &quot;ابدأ&quot; في التقاط نافذة في نفس الوقت الضغط على مفتاح على وحدة تحكم الارواء. ملاحظة: من المستحسن لتسجيل timepoint حيث تم تبادل الحلول (وهذا يمكن أن يتم ذلك باستخدام &quot;ملاحظات&quot; وظيفة، وجدت ضمن علامة التبويب الاستحواذ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء نضح نفس البروتوكول باليودنانوغرام الخلايا معربا عن جهاز استشعار أنه من المتوقع أن تكون إما مشبعة أو غير منضم تحت شرط التجريبية. ملاحظة: هنا، FLIPQTV3.0_1.5μ، الذي المشبعة تحت حالة تجريبية، ويستخدم كعنصر تحكم، الشكل 6 هذه التجارب السيطرة ضرورية لتأكيد أن هذا هو بسبب التغير الفعلي في الركيزة التغيير الكفاءة والحنق لا. بسبب التغير في العوامل الأخرى مثل درجة الحموضة الخلوية. </li></ol> 3. تحليل ما بعد التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص عينة إذا حدث الانجراف أثناء التجربة. رسم المناطق ذات الاهتمام (ROI) ليالي على الصورة التي اتخذت في timepoint 0، ثم حرك شريط انزلاق في الجزء العلوي من النافذة التصوير ومعرفة ما اذا كان الخلايا تسقط من رويس في الصور التي التقطت في وقت لاحق في التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الإجابة بنعم، ثم استخدم وظيفة تتبع لتصحيح الانحراف من جانب أول، وخلق أقنعة حول الخلايا عن طريق تحديد قناع - الجزء، ثم حرك الخط الذي يحدد لقطع HIGhlight المناطق التي تحتوي على الخلايا. تتبع المناطق بالضغط قناع - تتبع الجسيمات - تتبع الجسيمات الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة رسم رويس والمنطقة الخلفية عند الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير كثافة متوسط ​​رويس على مدى التجربة. انقر الاحصائيات - تصدير - البيانات / نسبة timelapse. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الكفاءة الحنق والكمي لتركيز الركيزة ليست ضرورية، رسم مدار الساعة من نسبة كثافة (بحكم المانحة م والقابل، / م السابقين المانحة المانحة) كوكيل لديناميات الركيزة. لتحديد تركيز عصاري خلوي، وحساب الحد الأقصى والحد الأدنى من التغيير النسبة (أي في تشبع وغياب الركيزة، على التوالي)، Δr ماكس - Δr دقيقة، من خلال الانحدار غير الخطية من Δratio (Δr) مع المعادلة التالية: Δr = [S] / (K + د [S]) × (Δr <suب&gt; ماكس - Δr دقيقة) + Δr دقيقة حيث [S] هو تركيز الركيزة في العصارة الخلوية. ويتم احتساب القيم Δr دقيقة تم الحصول عليها، والتشبع (S) من أجهزة الاستشعار في Δr على النحو - باستخدام Δr ماكس S = (Δr - Δr دقيقة) / (Δr ماكس - دقيقة Δr) S يمكن تحويلها إلى مزيد من تركيز الركيزة [S] باستخدام المعادلة التالية: S = [S] / (K + د [S]) ملاحظة: يجب أن تكون كثافة القابل السابقين القابل قناة م تآمر أيضا لفحص ما إذا كانت حالة تجريبية أثرت في مضان من متقبل مباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما لوحظ الانجراف خط الأساس بسبب الصورة تبيض، إجراء تصحيح خط الأساس. للقيام بذلك، رسم شدة المانحة ومتقبل على مر الزمن (الشكل 5A). ثم تحديد timepoints المستخدمة في اله الأساسية، وفقا للتأخير في نظام الارواء ونشاط النقل معينة الخلية (الشكل 5B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المناسب polynominal التي تصف أفضل خط الأساس. ثم، وتطبيع كثافة الخام من كل timepoint إلى خط الأساس (الشكل 5C). حساب نسبة كثافة (بحكم المانحة م والقابل، / م السابقين المانحة المانحة) من شدة المانحة ومتقبل تطبيع. </li></ol>

<ol>
	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

نجاح تجارب التصوير يعتمد على عدد قليل من العوامل الهامة. واحد من هذه العوامل هو تقارب من أجهزة الاستشعار المستخدمة، كما نوقش أعلاه. التركيز المطلق من الركيزة في مقصورة التحت خلوية من الفائدة، ومع ذلك، غالبا ما يكون غير معروف. لذا نوصي تحاول أجهزة استشعار متعددة متداخ...

بسبب التقدم الملحوظ في التقنيات التي تتيح فحص Transcriptome على وبروتيوم على المستوى الخلوي، فقد أصبح من الواضح الآن أن الكيمياء الحيوية والتدفق الناتج من المركبات والأيونات هي غاية خلية من نوع معين. على سبيل المثال، في الكبد الثدييات، تتم تدهور الجلوتامين متتابعة والتوليف في وقت واحد من قبل خلايا والخلايا حول الأوعية البابية محيط بالوريد على التوالي، والتغذية الأمونيوم لدورة اليوريا في نوع من الخلايا السابقة في حين تستهلك الأمونيا الزائدة في الأخير 1-3. في بعض الحالات، تم الكشف عن عدم التجانس البيوكيميائية كبيرة حتى في واحد &quot;نوع من الخلايا&quot; 4، 5. بالإضافة إلى مثل هذه النوعية المكانية، ومستويات الأيض الخلوية والأيونات هي ديناميكية للغاية (على سبيل المثال، يشير الجزيئات مثل كا 2 + والنيوكليوتيدات الحلقية). الأنماط الزمانية المكانية من المركبات والأيونات غالبا ما تلعب أدوارا حاسمة في نقل الإشارة. Monitoring ديناميات الخلوية من المركبات والأيونات، ومع ذلك، تشكل تحديا فريدا من نوعه. في كثير من الحالات التغير في تركيزات هي سريعة وعابرة، والتي تجسدت في حالة إشارة الجزيئات مثل كا 2 +، والذي يضمحل داخل ~ 20 ميللي ثانية في العمود الفقري شجيري 6. بالإضافة إلى ذلك، تجزئة المسارات البيوكيميائية داخل وبين خلايا يجعل من الصعب تحديد ديناميات الأيضية والأيونات باستخدام استخراج والعمود اللوني / تقنيات قياس الطيف الكتلي. وتستخدم الآن على نطاق واسع أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا للجزيئات البيولوجية نظرا لدقة الزمانية المكانية العالية التي يسمح للمجرب لدراسة الديناميات الجزيئية قصيرة الأجل و / أو مجزأة (مراجعة في 7 و 8). يمكن تقريبا أن تقسم هذه المجسات المشفرة وراثيا إلى فئتين؛ أجهزة الاستشعار القائم على كثافة وأجهزة الاستشعار ratiometic. تتكون أجهزة الاستشعار القائم على كثافة عادة من مجال ملزمة والانفلونزاorescent البروتين (FPS)، والمذاب ملزم إلى المجال ملزمة بتغيير شدة الفلورسنت. أجهزة الاستشعار Ratiometic، من ناحية أخرى، وغالبا ما تستفيد من نقل الطاقة الرنين فوستر (الحنق) بين اثنين من ضباط التي تعمل كزوج الحنق. تتكون هذه المجسات من مجال ملزمة واثنين من ضباط، والمذاب ملزم الحث على التغيير في الكفاءة الحنق بين ضباط اثنين. وقد تم تطوير عدد كبير من أجهزة الاستشعار لنواتج الأيض المهمة بيولوجيا والأيونات في العقد الماضي 8، 9. واحدة من إمكانية إثارة مثل أجهزة الاستشعار التي تقدمها المشفرة وراثيا هو استخدامها في تحليل عالية الدقة من عمليات النقل الغشاء، التي كانت في السابق ليس من السهل للكشف على المستوى الخلوي. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا تسهيل تحليل آليات النقل مثل الركيزة خصوصية ودرجة الحموضة الاعتماد 10، 11. علاوة على ذلك، في تركيبة مع الدقة الوراثيةources مثل مكتبة رني يبني للكائنات النموذج، أصبح من الممكن الآن لإجراء عمليات تفتيش على نطاق الجينوم لعمليات النقل باستخدام أجهزة استشعار الرواية المرمزة وراثيا. في الواقع، واستخدام المشفرة وراثيا الرصاص استشعار لاكتشاف نقل uncharacterized سابقا في حالات متعددة 12 و 13. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت مختبرنا سلسلة من أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق لالجلوتامين. لقد أثبتنا أن مستويات الجلوتامين الخلوية يمكن تصور استخدام مثل أجهزة الاستشعار الحنق الجلوتامين 10. تتكون هذه المجسات من المانحين الحنق (mTFP1) إدراجها في البروتين البكتيري الجلوتامين ملزمة glnH، ومتقبل الحنق (فينوس) في C-تيرميني من glnH (الشكل 1). الحنق كفاءة هذه المجسات على خفض ملزم من الجلوتامين، مما أدى إلى انخفاض نسبة كثافة متقبل / المانحة. تنظيم عمليات النقل غرامة الجلوتامين مهم في العمليات البيولوجية مثل neurotransmission 14 و 15 و الحفاظ على دورة اليوريا في الكبد 1، 16، 17. نحن هنا تظهر منهجية تحليل أنشطة النقل مع أجهزة الاستشعار عن الحنق الجلوتامين، وذلك باستخدام المجهر مضان واسعة المجال انشاء. الهدف من التجارب المعروضة هنا هي للكشف عن أنشطة نقل في خلية واحدة ودراسة الركيزة خصوصية لنقل أعرب عابر.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.</td></tr><tr><td>Excitation filter (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Band width 450-460 nm</td></tr><tr><td>Excitation filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Band width 490-510 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Band width 475-505 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Band width 520-550 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (FRET channels)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Long pass, 470 nm cut off</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (YFP channel)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mCherry filter set</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic fluorescence objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td></tr><tr><td>Laminar-flow chambers</td><td>C&amp;amp;L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Other larminar-flow chambers would also work.</td></tr><tr><td>Chambered slide</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Software supporting ratiometric measurements</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Used with Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm circular glass cover slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>In case VC-MPC-TW is used</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Other transfection reagents can also be used.</td></tr><tr><td>Solution A (Hank&#039;s buffer)</td><td></td><td></td><td>9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.04 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution C</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.2 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution D</td><td></td><td></td><td>Solution A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution E</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution F</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. أصبحت مجموعة متنوعة هائلة من مثل أجهزة الاستشعار عن الجزيئات البيولوجية المتاحة في السنوات ال 15 الماضية، وأصبح بعض من الأدوات التي لا غنى عنها التي يتم استخدامها بشكل روتيني في العديد من المختبرات. واحدة من التطبيقات المثيرة من أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا هو استخدام هذه المجسات في التحقيق في عمليات النقل الخلوية. خصائص نقل مثل حركية والخصوصيات الركيزة يمكن التحقيق على المستوى الخلوي، وتوفير الإمكانيات لتحليلات محددة من أنشطة النقل خلية من نوع. في هذه المقالة، سوف نظهر كيف يمكن ملاحظة ديناميات نقل باستخدام ترميز وراثيا استشعار الجلوتامين كمثال على ذلك. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية سيتم مناقشتها.

يتم تمثيل نموذجي التجارب الوقت بالطبع في الشكل 2. في هذه التجارب، وأجهزة الاستشعار الحنق الجلوتامين مع الانتماءات من 8 ملي (FLIPQTV3.0_8m، الشكل 2A و 2B) و 100 ميكرومتر (FlipQTV3.0_100 μ C و D) والتعاون مع أعربت واجبة مبادل الأحماض الأمينية في خلايا ASCT2 18 ...

Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

هذه المادة سوف تظهر كيفية رصد ديناميات الجلوتامين في الخلايا الحية باستخدام الحنق. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية وسوف تناقش لأجهزة الاستشعار الجلوتامين المشفرة وراثيا.

الجلوتامين الجريان التصوير باستخدام مجسات مشفرة وراثيا

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Views.  Virginia Tech.  هذه المادة سوف تظهر كيفية رصد ديناميات الجلوتامين في الخلايا الحية باستخدام الحنق. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريب...

Video: Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

التصوير النهج لإجراء تقييمات للسمية الأكسدة باستخدام أجهزة استشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Cancer Research

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental transitions in plants. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)-based biosensor that allows monitoring of cellular GA levels in vivo. By measuring a fluorescence emission ratio of nuclear localized-GPS1 (nlsGPS1), spatiotemporal mapping of endogenously and exogenously supplied GA gradients in different tissue types is feasible at a cellular scale. This protocol will describe how to image nlsGPS1 emission ratios in three example experiments: steady-state, before-and-after exogenous gibberellin A4 (GA4) treatments, and over a treatment time-course. We also provide methods to analyze nlsGPS1 emission ratios using both Fiji and a commercial three-dimensional (3-D) micrograph visualization and analysis software and explain the limitations and likely pitfalls of using nlsGPS1 to quantify gibberellin levels.

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer-based biosensor for measuring the cellular levels of gibberellin phytohormones with a high spatiotemporal resolution. This protocol reports on the method to visualize and quantify cellular gibberellin levels using the genetically encoded nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls and root tips.

نقل نحققها جبرلين الخلوية مستويات استخدام الطاقة الرنين فورستر NlsGPS1 بيوسينسور (بكى)

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

Developmental Biology

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biology

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Neuroscience

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

مقايسة الفائق كالسيوم-التمويه لدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية جليكاين/د-سيرين وغلوتامات

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

التصوير الحي لحالة الميتوكوندريا الجلوتاثيون ريدوكسي في الخلايا العصبية الأولية باستخدام مؤشر قياس النسب

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

A للمسح<em&gt; في فيفو</em&gt; الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em