Ce travail a été soutenu par les contributions philanthropiques de la John G. et Marie Stella Memorial Foundation Kenedy (Grant N ° 0727033) et l&#39;Alliance Melanoma Research. Les auteurs tiennent à remercier l&#39;Université de tissus Cancer Center Texas MD Anderson institutionnelle de la Banque (ITB) de coordonner la distribution des tissus et de la collecte et de faciliter la recherche translationnelle, ainsi que le Dr Ignacio Wistuba, le Dr Victor Prieto, le ministère MD Anderson Cancer Center de Pathologie et le Programme de tir mélanome Lune. Enfin, les auteurs tiennent à remercier tous les patients et les familles touchées par le mélanome.

Déclaration éthique: Ce protocole est approuvé par l&#39;Université du Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Echantillon achats <ol><li> Prélever des échantillons de tissus de recherche du surplus tumeur et les tissus normaux connexes 10-12. Stocker les spécimens sur la glace humide pour éviter autolyse. </li><li> Envoyer tous les tissus, les dispositifs médicaux et les corps étrangers enlevés au cours d&#39;une intervention chirurgicale pour le Département de pathologie pour examen nécessaire afin de faciliter un diagnostic pathologique. </li><li> Poignée tissu alloué à la recherche, conformément à la recherche et aux politiques applicables de la banque de tissus et de procédures. REMARQUE: la collecte des échantillons biologiques implique la coordination des pathologistes pathologistes &#39;assistants, technologistes en histologie et spécialistes de l&#39;approvisionnement des tissus,. </li></ol> 2. Assurance Qualité pathologie (AQ) <ol><li> Compléter et vérifier les dossiers des patients comme une mesure d&#39;AQ tôt et consulter un médecin pour examiner pa diagnostictients dossiers (rapports de pathologie, les lames de tissus, etc.) et des échantillons de tissus. Des échantillons de tissus juge sur les caractéristiques morphologiques d&#39;intérêt tels que le pourcentage de la tumeur, la nécrose, l&#39;interface tissu tumoral, etc. Ceci est en conformité avec les meilleures pratiques biodépôt 10-12. </li><li> Après l&#39;examen initial, des examens périodiques de données et banque d&#39;échantillons des échantillons de recherche pendant toute la durée du séjour des échantillons biologiques. </li><li> Résultats de Lien et annotations d&#39;enquêtes histopathologiques et d&#39;autres à des échantillons et fournissent ces données pour les chercheurs grâce à un système de logiciel de biodépôt propriétaire. REMARQUE: processus d&#39;assurance qualité garantissent l&#39;intégrité des deux les aspects cliniques et techniques des opérations biodépôt. </li><li> Effectuer des tests génétiques et moléculaires pour vérifier et caractériser les échantillons pour une utilisation clinique. </li><li> Recueillir et analyser les données basées sur les commentaires des chercheurs qui ont utilisé les échantillons pour des expériences de laboratoire. Pisteéchantillons en utilisant la technologie de code à barres. Ce système de suivi électronique est également préconisée dans les meilleures pratiques biorespository 10-12. </li></ol> 3. Spécimen / Traitement des tissus <ol><li> Toujours stocker des échantillons de tissus frais sur la glace mouillée, et le processus aussi rapidement que possible, afin de limiter les changements induits par l&#39;extraction de l&#39;échantillon de tissu de son environnement naturel. Procédé normale tumeur appariés et des échantillons de tissus tumoraux séparément pour éviter la contamination croisée. REMARQUE: Basé sur les protocoles de recherche, de traitement des échantillons biologiques peut impliquer la collecte des spécimens dans un ou plusieurs types de médias. </li><li> Avant de commencer le processus, préparer une boîte de Pétri stérile de culture, un scalpel, ainsi que d&#39;une aiguille ou une pince pour le traitement des tissus. Veiller à ce que les tubes ont été préparés, étiquetés et mis en oeuvre pour limiter le temps de traitement des échantillons (figure 2). </li><li> Toutes les informations pertinentes de tissu, telles que le nom du patient, le numéro, le traitement, la date dela chirurgie, et d&#39;autres informations pertinentes peut être approprié pour l&#39;étude, devraient être facilement accessibles dans une base de tissu institutionnel. Des informations limitées patient doit être maintenu dans le laboratoire sous forme papier ou de feuille de calcul. NOTE:. Seulement recueillir des informations échantillons biologiques pertinents à la nature du savoir de la recherche, de la recherche biomédicale fondamentale, la recherche clinique, la recherche translationnelle, etc. Pour plus d&#39;informations spécifiques à la maladie, le personnel biodépôt devrait recueillir des données jugées nécessaires par la littérature actuelle et organismes directeurs de assurer le bon diagnostic et la recherche de sens. Cela inclut, mais ne se limite pas aux classes de tumeurs et le cancer informations de stockage intermédiaire. </li><li> Planifiez toutes les expériences ultérieures souhaitées à l&#39;avance, de décider de la taille des coupes de tissus requis pour chaque type d&#39;analyse, ainsi que l&#39;emplacement des excisions. Idéalement, bien impossible, toutes les analyses doivent être représentatifs de la coupe de tissu ensemble afin de rendre compte de heterogenei de tissusTy et limiter les biais d&#39;analyses en aval. Disposez tous les éléments nécessaires à l&#39;avance comme le montre la figure 2. </li><li> Placer l&#39;échantillon de tissu dans la boîte de culture Petri ouverte, à plat contre la surface. REMARQUE: autorise uniquement le personnel autorisé biodépôt à manipuler les échantillons identifiés et à examiner les données de santé identifiés. Les enquêteurs devraient uniquement accéder aux identifiants de patients comme le permet la signés consentements éclairés et réglementé par la CISR. Tous les échantillons doivent être adéquatement étiquetés et doivent comprendre au minimum, un numéro d&#39;identification des tissus et des tissus de type unique. Ne pas inclure les RPS dans les étiquettes, conformément à la réglementation HIPAA. </li><li> Inspecter l&#39;échantillon de tous les angles, à acquérir une meilleure compréhension de sa structure et les dimensions. Epingler l&#39;échantillon au fond du plat avec l&#39;aiguille, et de procéder à découpent le tissu le long de son axe plus grand et le meilleur représentant. </li><li> Découpez un petit morceau de tissu et le placer dans un stérile 1,5 ml MICRTube ocentrifuge contenant 1 ml de solution d&#39;ARN-stabilisation. Cet échantillon peut être placé sur de la glace pendant le reste du procédé et stocké à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec de l&#39;ARN, les gants doivent toujours être portés, et des conseils de filtres RNase-Free doit être utilisé pour limiter les chances de la dégradation et de la contamination de l&#39;ARN. </li><li> Étalez une cassette ouverte et pré-étiquetés biopsie dans le couvercle de la boîte de culture Petri. Découper une tranche de tissu pas plus épais que 3 à 5 mm et le transférer sur la cassette. Placez la cassette dans 10% formol neutre tamponné (FBN) pour un minimum de 72 heures. Transférer la cassette dans 70% d&#39;éthanol pour le stockage à long terme avant la paraffine-encastrement. REMARQUE: étiquetage des cassettes doit être effectué au crayon ou avec des marqueurs recommandés que l&#39;utilisation de xylène pendant le traitement, autrement effacer les étiquettes. </li><li> Découper un morceau de tissu et le placer dans un moule de tissu. Couvrir la coupe de tissu à la température de coupe optimale (OCT) composé, et de geler immédiatementà -20 ° C pendant cryosectioning. Cette section de tissu peut être conservé à -20 ° C jusqu&#39;au moment de cryosectioning. </li><li> Découper une ou plusieurs pièces de tissu et les transférer vers un tube de 50 ml contenant du tampon MACS (1x tampon phosphate salin (PBS), 0,5% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)) pour l&#39;écoulement ultérieur analyse par cytométrie . Pour la cytométrie de flux, de plus grands échantillons peut être préférable que les cellules peuvent être perdues lors de la dissociation de la tumeur, la fixation cellulaire et perméabilisation lorsque requis. Généralement, cette section peut être prise à la fin, une fois toutes les autres pièces ont été traitées. Les restes représentant échantillon de tumeur peut être utilisé pour la cytométrie de flux. Eventuellement, ce tube peut être conservé à 4 ° CO / N ou utilisé pour cytométrie de flux coloration digestion immédiatement après dans une suspension de cellules (voir l&#39;étape 4 - cytométrie en flux coloration). </li><li> Couper reste de tissu en morceaux pas plus gros qu&#39;une taille maximale de 0,5 mm x 0,5 mm et les transférer à cryogéniqueflacons pour congélation immédiate dans l&#39;azote liquide. Ces échantillons d&#39;encliquetage congelés peuvent être utilisés pour de futures analyses et à des fins de collaboration. NOTE: Des précautions supplémentaires devraient être prises lorsque l&#39;on travaille avec de l&#39;azote liquide en contact direct peut causer des blessures graves. Les yeux doivent être protégés par des lunettes de sécurité avec écrans latéraux ou avec un écran facial. Des gants cryogéniques devraient également être portés pour protéger contre les brûlures d&#39;azote liquides causées par des éclaboussures et le contact direct. Les gants doivent ajuster correctement, mais être suffisamment lâche pour être retiré rapidement si splash de l&#39;azote liquide en eux. </li></ol> 4. La coloration par cytométrie en flux <ol><li> L&#39;homogénéisation des tissus <ol><li> Préparer milieu de digestion avec du DMEM (40 ml), de DNase I (50 U / ml) et de la collagénase I (2 mg / ml). Placez frais ou O tumeur / N-stockée dans un tampon MACS dans le couvercle d&#39;une boîte de Pétri, et plonger avec un milieu de digestion. NOTE:. Méthodes de digestion Il existe différentes, chacune ayant ses avantages (par exemple, la surface des cellules de protéines expression, la viabilité). Assurez vous d&#39;avoir la bonne méthode pour votre application en aval souhaitée. </li><li> Pin tumeur au fond de la boîte avec une aiguille, et la coupe de l&#39;extérieur pour centrer avec un scalpel jusqu&#39;à ce que la tumeur a une texture pâteuse. Transfert mélange de la tumeur à un tube de 50 ml, joint et le placer dans un sac en plastique pour éviter les fuites. Transfert tube pour un incubateur, et tourner à 225 tours par minute, 37 ° C, 1 h. </li><li> Filtre tumeur suspension de cellules à travers un tamis de 70 pm de la cellule. Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg, 4 ° C, 5 min. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de tampon FACS (500 ml de PBS, 1 ml de 0,5 M de stock EDTA, 10 ml de FCS ou FBS). </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et remettre en suspension à une concentration de 1x10 7 cellules / ml. Transfert 100 pi par puits (10 6 cellules) dans une plaque de 96 puits à fond rond pour la coloration. </li></ol></li><li> La viabilité et la coloration des anticorps <ol><li> Ajouter 200 pi de solution viabilité de tache pour chaque puits et mélanger. Incubate pendant 30 minutes, à 4 ° C, dans l&#39;obscurité. Isoler les cellules à 250 xg, 4 ° C, 5 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Ajouter le mélange d&#39;anticorps à concentration recommandée (selon le fabricant) / titré pour les antigènes de surface dans 200 pi de tampon FACS. Incuber les cellules à 4 ° C, 30 min, à l&#39;obscurité. Isoler les cellules à 250 xg, 4 ° C, 5 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Laver avec 200 pi de tampon FACS, centrifuger les cellules à 250 xg, 4 ° C, 5 min, et aspirer le surnageant. Reprendre les cellules dans 200 pi de tampon FACS et de procéder à un cytomètre en flux pour l&#39;acquisition et l&#39;analyse. NOTE: Si vous effectuez flux intracellulaire coloration de cytométrie, effectuez les étapes de fixation et de perméabilisation et la coloration intracellulaire entre les étapes 4.2.2 et 4.2.3. Si vous effectuez cytokine coloration, les cellules doivent être pré-activé coloration précédent comme l&#39;a recommandé, et d&#39;un inhibiteur du transport intracellulaire des protéines et la sécrétion tels que monensin devrait être utilisé pendant l&#39;activation deassurer la rétention de facteurs solubles. Les cellules fixées peuvent être conservées à court terme (1 semaine) à 4 ° C dans l&#39;obscurité avant l&#39;acquisition sur un cytomètre de flux. </li></ol></li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis.">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li><li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis.">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li><li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages.">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. 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The authors have no conflicts of interest to disclose.

En fin de compte, les méthodes de traitement doivent être dictées par l&#39;hypothèse souhaité et prévu des essais techniques à effectuer (Figure 1). La section suivante sert un aperçu de décrire dosages potentiels qui peuvent être effectuées sur ces coupes de tissus. Il est en aucun cas un aperçu exhaustif, mais est destiné à aider à guidage méthodes de traitement des échantillons et choix des essais en aval en décrivant les techniques et la liste de leurs forces et faiblesses. <p...

La recherche médicale a énormément bénéficié de l&#39;étude de deux lignées de cellules humaines et des modèles animaux. Les lignées cellulaires permettent un meilleur contrôle des composants dans un système, ainsi que l&#39;utilisation de cellules de l&#39;organisme approprié. Travailler avec des cellules humaines, tandis que plus représentatif, présente un aperçu simplifié radicalement les mécanismes qui peuvent être responsables de la santé et de la maladie, parce que les lignées cellulaires peuvent ne pas récapituler l&#39;impact d&#39;autres cellules stromales, composants et organes qui peuvent influer sur les réponses 1. D&#39;autre part, les modèles animaux, mais pas tout à fait exact de reproduction dans la maladie humaine et l&#39;hétérogénéité génétique, offrent un meilleur aperçu en permettant l&#39;entrée de systèmes animaux entiers dans la plupart des modèles 2,3. Lacunes côté, les deux méthodes ont leurs avantages et sont complémentaires. Cependant, l&#39;objectif principal reste à étudier les cellules et d&#39;organes humains, dans un système multi-organe corps entier. En conséquence, la recherche translationnelle a taken de grands progrès en vue de faciliter l&#39;étude des organes et tissus humains extraites de patients, afin de mieux saisir les mécanismes maladie sous-jacente. La recherche translationnelle offre l&#39;avantage d&#39;étudier le résultat des traitements et des maladies dans tout le corps et dans les cellules appropriées, fournissant ainsi le meilleur des deux mondes entre la cellule et animale travail 4. La recherche translationnelle est également pas sans défauts. Spécimens récoltés provenant de patients humains, lors de l&#39;enlèvement de l&#39;hôte, sont immédiatement soumis à une ischémie et d&#39;autres facteurs externes à partir de laquelle ils seraient autrement protégés. Cela peut entraîner des changements moléculaires et génétiques induites par le stress, et causer des biais dans les études ultérieures. Par conséquent, beaucoup d&#39;efforts ont été mis en extraction et le traitement des tissus par des méthodes strictes de préserver au mieux l&#39;orgue et l&#39;intégrité des cellules pour des études en aval 5. Surtout, les applications futures doivent être considérés de près lors de la sélection des méthodes of traitement des échantillons humains, que certaines méthodes peuvent être préjudiciables à des composants cellulaires et les voies de signalisation tout en épargnant les autres. Pour toute recherche impliquant des tissus humains, les questions de réglementation doivent être abordées. Après les rapports de Tuskegee et Belmont, il y avait une acceptation croissante du fait que la recherche biomédicale a été associée à des risques inhérents résultant souvent des dilemmes éthiques inévitables 6. La nécessité de normes nationales a été reconnue et le gouvernement fédéral a créé Institutional Review Board (IRB) comme un moyen de faire respecter les principes du Rapport Belmont (respect des personnes, la bienfaisance, de la justice). La CISR de toute institution est un comité de médecins, les chercheurs et les membres de la communauté qui sont responsables de la protection des participants à la recherche. Il exige que le consentement volontaire être obtenu à partir de tous les participants des études de recherche biomédicale, et que ce consentement soit documentée dans un consentement éclairé fo<html> rm. Le processus de consentement éclairé vise à fournir des informations adéquates à un participant, de sorte qu&#39;une décision éclairée peut être faite ou non d&#39;inscrire dans une étude, ou de continuer à participer. À cet égard, le document de consentement éclairé doit avoir une bonne lisibilité et doit être écrit dans un langage qui peut être facilement comprise (6 e à 8 e niveau de lecture de qualité) par la population cible. La possibilité de la contrainte ou influence indue doit être minimisée, et le sujet doit être donné suffisamment de temps pour envisager une participation. Le participant doit également être autorisés à exercer leur droit de retirer son consentement à tout moment au cours de l&#39;étude, sans pénalité. Consentement éclairé est un pré-requis obligatoire pour la participation d&#39;un sujet dans la recherche et il est aussi légalement à compter du 7. Comme par les règlements pour la protection des sujets humains 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), les participants de l&#39;étude doivent être informés de l&#39;objet de la recherche, les procédures impliquées dans la recherche, les alternatives à la participation, tous les risques prévisibles et les malaises (y compris non seulement des blessures physiques, mais aussi un préjudice psychologique, sociale, économique ou possible, d&#39;inconfort ou gêne), les avantages de la recherche pour la société et, éventuellement, à l&#39;individu, la durée de l&#39;objet devrait participer, personne à contacter pour obtenir des réponses aux questions ou dans le cas d&#39;une blessure liée à la recherche ou d&#39;urgence, une déclaration indiquant que la participation est volontaire et que le refus de participer ne sera pas entraîner des conséquences ou toute perte d&#39;avantages tels que un compromis dans les soins cliniques réguliers que le participant est autrement habilité à recevoir en raison de son / ses diagnostics, et enfin une déclaration concernant le droit de la personne à la confidentialité et le droit de se retirer del&#39;étude à tout moment sans aucune conséquence. Les échantillons de tissus de participants qui se retirent consentement au cours de l&#39;étude ne devraient pas être mis en réserve et doivent être immédiatement épuisées. Renonciation à un ou plusieurs éléments du consentement éclairé peut être obtenu à partir de la CISR pour certains projets de recherche qui pourraient pratiquement pas se faire sans une modification des éléments requis ou pour des études où les éléments nécessaires ne sont pas applicables. Un grand soin doit être pris pour assurer la confidentialité des données. La Loi sur la responsabilité Health Insurance Portability et (HIPAA) est une loi fédérale qui empêche utiliser ou de divulguer «renseignements protégés de la santé&quot; (PHI) sans le consentement écrit des participants. PHI comprend mais ne se limite pas à l&#39;information de santé transmis ou maintenu sous quelque forme ou moyen et comprend des champs qui pourraient être utilisés pour identifier une personne 9. Grâce à ce travail, nous visons à décrire le protocole qui doit être suivi pendant tissue traitement - y compris les achats, le stockage et soulignent l&#39;importance de suivre ces lignes directrices strictes de manière à minimiser les biais qui peuvent résulter en raison des contraintes d&#39;un tissu est soumis à lors de l&#39;extraction. Nous nous efforçons également de fournir un bref aperçu des essais ou d&#39;analyses (Figure 1) qui pourraient être effectuées sur ces échantillons en aval afin que les lecteurs peuvent porter un jugement qualifié sur ce test (s) convient le mieux à leurs besoins.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel disposable scalpels</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>58931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-stabilizing solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MAX-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>StatLab Medical Products</td>
			<td>28600-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Containers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-032-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature solution (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m cell strainers</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead stain solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

working with human tissues for translational cancer research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

<html> Les résultats affichés ci-dessous illustrent l&#39;écoulement stratégie cytométrie de déclenchement d&#39;une large phénotypage immunitaire sur une tumeur de mélanome traités. Le jour de la coloration, l&#39;échantillon de tissu a été digéré avec de la collagénase et on les homogénéise et DNase I I incubation pendant 60 min, à 37 ° C sous 225 RPM rotation. Après la digestion, la suspension cellulaire a été filtrée à travers un tamis cellulaire de 70 um pour éliminer les débris et les cell...

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Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Travailler avec les tissus humains pour la recherche translationnelle sur le cancer

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K vues.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

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Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

Génération de base de données complète en oncologie thoracique - Outil de recherche translationnelle

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Recherche

Médecine

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Création et propagation des tumeurs de l&#39;homme en rétinoblastome immunitaire chez les souris déficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

L&#39;infection ex vivo de tissus vivants avec des virus oncolytiques

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Génération expérimentale de carcinome Associated fibroblastes (CAF) à partir des fibroblastes mammaires

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Traitement des mammoplastie de réduction et de tissus humains mastectomie pour Culture Cellulaire

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma and devastating tissue loss. Despite favorable and highly encouraging early and intermediate functional outcomes, rejection of the highly immunogenic skin component of a VCA and potential adverse effects of chronic multi-drug immunosuppression continue to hamper widespread clinical application of VCA. Therefore, research in this novel field needs to focus on translational studies related to unique immunologic features of VCA and to develop novel immunomodulatory strategies for immunomodulation and tolerance induction following VCA without the need for long term immunosuppression.
This article describes a reliable and reproducible translational large animal model of VCA that is comprised of an osteomyocutaneous flap in a MHC-defined swine heterotopic hind limb allotransplantation. Briefly, a well-vascularized skin paddle is identified in the anteromedial thigh region using near infrared laser angiography. The underlying muscles, knee joint, distal femur, and proximal tibia are harvested on a femoral vascular pedicle. This allograft can be considered both a VCA and a vascularized bone marrow transplant with its unique immune privileged features. The graft is transplanted to a subcutaneous abdominal pocket in the recipient animal with a skin component exteriorized to the dorsolateral region for immune monitoring.
Three surgical teams work simultaneously in a well-coordinated manner to reduce anesthesia and ischemia times, thereby improving efficiency of this model and reducing potential confounders in experimental protocols. This model serves as the groundwork for future therapeutic strategies aimed at reducing and potentially eliminating the need for chronic multi-drug immunosuppression in VCA.

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascularized Composite Allotransplantations (VCA) have become a clinical reality. However, broad clinical application of VCA is limited by chronic multi-drug immunosuppression. The authors present a reliable and reproducible large animal model to translate novel immunomodulatory strategies that can minimize or potentially eliminate the need of immunosuppression in VCA.

Un Heterotopic porcine Hind Membre Transplant modèle modifié translationnelle vascularisé composite Allotransplantation (VCA) de recherche

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

M. imagerie moléculaire du cancer de la prostate avec un agent de contraste ciblé Petit moléculaire CLT1 Peptide

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

La mort cellulaire associée à la mitose anormale constatée par imagerie confocale dans des cellules vivantes du cancer

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...