이 작품은 존 G. 마리 스텔라 케네디 기념 재단 (보조금 # 0727033)과 흑색 종 연구 얼라이언스의 자선 기부금에 의해 지원되었다. 저자는 박사 이그나시오 Wistuba 박사 빅터 Prieto의 MD 앤더슨 암 센터의 부서뿐만 아니라, 조직 분포 및 수집을 조정 및 중개 연구를 용이하게하기 위해 텍사스 MD 앤더슨 암 센터 기관 조직 은행 (ITB)의 대학 감사드립니다 병리학 및 흑색 종 달 총 프로그램. 마지막으로, 저자는 흑색 종에 의해 영향을받는 모든 환자와 가족을 인정하고 싶습니다.

윤리 문 :이 프로토콜은 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학에 의해 승인됩니다. 1. 표본 조달 <ol><li> 잉여 종양 및 관련 정상 조직 10-12에서 연구 조직 샘플을 수집합니다. 젖은 얼음에 보관 검체는자가 분해를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 병리학 적 진단을 용이하게하기 위해 모든 조직, 의료 기기 및 필요한 검사에 대한 병리학 부서 수술 중 제거 이물질을 보냅니다. </li><li> 적용 할 수있는 연구 조직 은행의 정책 및 절차에 따라 연구에 할당 된 조직을 처리합니다. 참고 : Biospecimen 컬렉션 병리학의 조정을 포함, 병리학 &#39;조수, histotechnologists 및 조직 조달 전문가. </li></ol> 2. 병리학 품질 보증 (QA) <ol><li> 완료하고 초기 품질 보증 조치로 환자 기록을 확인하고 진단 PA를 검토 병리학에 문의tient 레코드 (병리학 리포트, 조직 슬라이드 등) 및 조직 샘플. 등이 biorepository 모범 사례 10-12에 따른다 등 종양의 비율, 괴사, 조직 종양 인터페이스, 같은 관심의 형태 학적 특성에 대한 판사의 조직 샘플. </li><li> 초기 검토 후, biospecimen의 숙박의 전체 길이 중 biorepository 데이터와 연구 샘플의주기적인 검토를 수행. </li><li> 샘플 및 기타 병리학 적 조사 결과로부터 링크와 주석 및 biorepository 독점 소프트웨어 시스템을 통해 연구원이 데이터를 제공한다. 주 : QA 프로세스 biorepository 동작 임상 기술적 측면 모두의 무결성을 보장한다. </li><li> 확인하고 임상 사용을 위해 샘플을 특징 짓는 유전 및 분자 테스트를 수행합니다. </li><li> 수집 및 실험실 실험 샘플을 사용하고 연구자의 의견을 기반으로 데이터를 분석 할 수 있습니다. 선로바코드 기술을 사용하여 샘​​플. 이 전자 추적 시스템은 biorespository 모범 사례 10-12에서 주장한다. </li></ol> 3. 표본 / 조직 처리 <ol><li> 항상 그것의 자연 환경으로부터 조직 샘플의 추출에 의해 유도 된 변화를 제한하기 위해, 가능한 한 빨리 신선한 조직 젖은 얼음 표본, 및 프로세스를 저장한다. 종양 정상적인 프로세스 정합 및 종양 조직 샘플을 별도의 교차 오염을 방지하기 위해. 주 : 연구 프로토콜에 근거는 biospecimen 처리 매체의 하나 이상의 유형에 시험편의 컬렉션을 포함 할 수있다. </li><li> 프로세스를 시작하기 전에, 멸균 페트리 배양 접시, 메스뿐만 아니라, 조직 처리 용 바늘 또는 집게를 준비한다. 튜브가 준비 표지 및 샘플 처리 (그림 2)의 시간을 제한하기 위해 배치되어 있는지 확인합니다. </li><li> 이러한 환자 이름, 번호, 치료, 날짜 등 모든 관련 조직 정보,수술 및 연구에 적합한 수있는 바와 같이, 다른 관련 정보는, 기관 조직 데이터베이스에 용이하게 접근해야한다. 제한된 환자 정보는 종이 또는 스프레드 시트 형태로 실험실에서 개최한다. 참고 :. 만 연구 즉의 성격과 관련 biospecimen 정보를 수집, 질병 별 정보 등 기본적인 생물 의학 연구, 임상 연구, 중개 연구는 biorepository 직원은 현재 문학이 필요하다고 인정하는 데이터를 관리하는 조직을 수집해야 적절한 진단과 의미있는 연구를 보장합니다. 하지만, 여기에는 종양 등급과 암 스테이징 정보에 한정되지 않는다. </li><li> 각 유형의 분석뿐만 아니라, 절개의 위치에 대해 요구되는 조직 절편의 크기를 결정하기 위해, 미리 원하는 모든 후속 실험을 계획한다. 불가능 비록 이상적으로, 모든 분석은 조직 heterogenei을 고려하기 위해 전체 조직 절편을 대표한다타이 및 다운 스트림 분석의 한계 바이어스. 그림 2에 도시 된 바와 같이 사전에 필요한 모든 항목을 배치합니다. </li><li> 표면에 평평하게 열려있는 페트리 배양 접시에서 조직 표본을 놓습니다. 참고 : 만 확인 된 샘플을 처리하고 확인 된 건강 데이터를 검토 할 수 biorepository 직원에게 권한을 부여 할 수 있습니다. 연구자는 IRB에 의해 규제로 서명 된 정보를 동의에 의해 허용하고 만 환자 식별자에 액세스해야합니다. 모든 시편은 적절하게 표시해야하며, 최소한의 고유 한 조직 식별 번호 및 조직 유형에 포함해야한다. HIPAA 규정에 따라, 라벨의 모든 건강 정보를 포함하지 마십시오. </li><li> 그 구조 및 치수의 더 나은 이해를 얻기 위해, 모든 각도에서 샘플을 검사한다. 바늘 접시의 바닥에 샘플을 핀과 최대 규모의 가장 대표적인 축을 따라 조직을 양분로 진행합니다. </li><li> 조직의 작은 조각을 잘라 멸균 1.5 ml의 MICR에 배치RNA 안정화 용액 1ml를을 포함 ocentrifuge 튜브. 이 샘플은 프로세스의 나머지 얼음에두고 필요할 때까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. 참고 : RNA로 작업 할 때 장갑을 항상 착용해야하고, RNAse가없는 필터 팁 저하와 RNA 오염의 기회를 제한하는 데 사용되어야한다. </li><li> 페트리 배양 접시의 뚜껑을 열고 미리 라벨링 생검 카세트를 배치합니다. 3-5mm보다 더 두꺼운 조직의 조각을 잘라 카세트로 전송. 72 시간의 최소 10 %에서 카세트 중성 포르말린 (NBF)를 놓습니다. 파라핀 매립하기 전에 장기간 저장을 위해 70 % 에탄올에 카세트를 옮긴다. 참고 : 카세트 라벨은 연필 또는 다른 라벨을 지워집니다 처리 중 자일 렌의 사용을 권장 마커로 수행되어야한다. </li><li> 조직의 조각을 잘라 및 조직 금형에 넣습니다. 최적 절단 온도 (OCT) 화합물에 조직 절편을 커버하고, 즉시 동결냉동 절편을 위해 -20 ° C에서. 이러한 조직 절편은 저온 절편 위해 준비 될 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 하나 잘라 또는 조직의 많은 조각 및 MACS 완충액을 함유하는 50 ㎖ 튜브 (1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 0.5 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA)) 세포 계측법 분석 후속 유동로 전송할 . 유동 세포 계측법에 필요한 경우 세포가 종양 탈퇴, 세포의 고정과 투과성으로시 손실 될 수 있으므로, 큰 샘플은 바람직 할 수있다. 일반적으로,이 섹션은 단부에서 취할 수 있고, 일단 다른 모든 부분이 처리되어있다. 남은 대표적 종양 샘플을 유동 세포 계측법에 사용될 수있다. 선택적으로,이 관은 4 ° CO 저장 / N 또는 세포 현탁액 (단계 4 참조 - 유세포 염색)로 유세포 염색 직후 분해에 사용될 수있다. </li><li> 0.5 mm X 0.5 mm의 최대 크기보다 조각 크지로 조직의 나머지 부분을 잘라 극저온로 전송액체 질소에 즉시 냉동을위한 유리 병. 미래 분석 및 공동 목적을 위해 이러한 스냅 냉동 샘플을 사용할 수있다. 참고 : 직접 접촉은 심각한 부상을 입을 수있는 액체 질소로 작업 할 때 여분의주의를 기울여야합니다. 눈은 측면 방패 또는 얼굴 가리개와 안전 안경을 보호해야합니다. 극저온 장갑도 튀는 직접 접촉에 의한 액체 질소 화상으로부터 보호하기 위해 착용한다. 장갑은 잘 맞지하지만 그들로 빨리해야 액체 질소 시작을 제거 할 수있을만큼 느슨하게해야한다. </li></ol> 4. 유세포 염색 <ol><li> 조직의 균질화 <ol><li> DMEM (40 ㎖)의 DNase I (50 U / ml) 및 콜라게나 제 I (2 ㎎ / ㎖)와 소화 매체를 준비한다. 페트리 접시의 뚜껑에 MACS 버퍼에 신선한 또는 O / N 저장된 종양을 배치하고 소화 매체 잠수함. 주 :. 다른 소화 방법은, 각각의 장점이 존재 (즉, 세포 표면 단백질 EXPression의, 생존). 당신이 원하는 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 적절한 방법이 있는지 확인하십시오. </li><li> 종양이 붙여 넣기 같은 질감을 가질 때까지 외부에서 바늘 접시의 바닥 및 절단에 핀 종양, 메스 중심합니다. 누수를 방지하기 위해 플라스틱 백에 50 ㎖ 튜브, 및 시일 장소 종양 믹스 옮긴다. 인큐베이터에 튜브를 전송하고, 225 RPM, 37 ℃, 1 시간에 회전. </li><li> 70μm 셀 스트레이너를 통해 종양 세포 현탁액을 필터. 250 XG, 4 ° C, 5 분 원심 분리기 세포 현탁액. 1 ML의 외과 버퍼 (500 ml의 PBS 1 ml의 0.5 M 재고 EDTA, 10 ML의 FCS 또는 FBS)에 재현 탁 세포 펠렛. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계수하고 1 × 107 세포 / ml의 농도로 다시 중단. 전송 염색에 대한 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 웰 당 100 μL (10 6 세포). </li></ol></li><li> 생존 및 항체 염색법 <ol><li> 각 생존 얼룩 솔루션의 200 μL를 잘 추가하고 섞는다. Incu어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 대한​​ BATE. 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운. </li><li> FACS 완충액 200 μL의 표면 항원에 대한 (업체 당) 추천 / 적정 농도로 항체 혼합물을 추가합니다. 어둠 속에서, 4 ° C를 30 분에서 세포를 품어. 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운. </li><li> , 외과 버퍼의 200 μL로 세척 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운. FACS 완충액 200 μL의 세포를 재현 탁하고 수집 및 분석에 대한 흐름 cytometer로 진행합니다. 참고 : 세포 내 유동 세포 계측법 염색을 수행하는 경우, 단계 4.2.2과 4.2.3 사이의 고정과 투과성으로 단계 및 세포 내 염색을 수행합니다. 사이토 카인 염색법을 수행하는 경우, 셀은 권장 미리 활성화 선행되어야 염색, 모 넨신 및 세포 내 단백질 수송 및 분비 억제제로 활성화 중에 표기수용성 요소의 유지를 보장합니다. 고정 된 세포는 유세포에 어두운 이전에 획득을 4 ° C에서 단기 (일주일)에 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis.">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li><li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis.">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li><li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages.">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. 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The authors have no conflicts of interest to disclose.

궁극적으로, 처리의 방법은 원하는 가설에 의해 결정 (그림 1)을 수행 할 기술적 분석을 예상해야합니다. 다음 섹션에서는 조직 섹션에서 수행 할 수있는 잠재적 인 분석을 설명하는 개요 역할을한다. 그것은 결코 완전한 개요를 의미하지만, 기술을 설명하고 자신의 강점과 약점을 나열하여 가이드 샘플 처리 방법 및 다운 스트림 분석의 선택에 도움을주기위한 것입니다으로하지 않?...

의학 연구는 인간 세포주 및 동물 모델 모두 연구 막대한 이득이다. 세포주 나은 시스템의 구성 요소의 제어뿐만 아니라, 적절한 유기체의 세포의 사용을 허용한다. 세포주는 응답 (1)에 영향을 미칠 수있는 다른 세포, 기질 구성 요소 및 기관의 영향을 요점을 되풀이하지 않을 수 있기 때문에, 더 대표하면서, 건강과 질병에 대한 책임을 질 수 있습니다 메커니즘을 획기적으로 단순화 된 스냅 샷을 제공, 인간 세포에 대한 작업. 반면에, 동물 모델은 인간의 질병 및 유전 적 이질성 재생 전적으로 정확하지 않지만, 대부분의 모델 동물 2,3-에서 전체 시스템의 입력을 허용함으로써 추가 통찰력을 제공. 단점은 제쳐 놓고, 두 방법은 자신의 장점을 가지고 상호 보완 적이다. 그러나, 주요 목표는 전신, 멀티 기관 시스템에서 인간의 세포와 기관, 연구 남아있다. 따라서, 중개 연구는 탁을 가지고더 나은 메커니즘을 기저 질환을 파악하기 위해, 인간의 기관 및 환자에서 추출한 조직의 연구를 촉진 장족의 발전 갖추고 있습니다. 중개 연구함으로써, 몸 전체에서 적절한 세포에서 치료 및 질환의 연구 결과와 동물 세포 일 (4) 사이 모두의 장점을 제공하는 이점을 제공한다. 중개 연구는 결함없이도 없습니다. 인간의 환자에서 수확 표본, 호스트로부터 제거시 즉시 허혈하고 그렇지 않으면 보호 될 수있는 다른 외부 요인을 실시한다. 이 스트레스 유발 분자 유전 학적 변화가 발생하고, 이후의 연구에서 편견의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 많은 노력이 가장 하류 연구 5 장기 및 세포의 무결성을 유지하기 위해 엄격한 방법으로 조직을 추출하고 처리에 투입되었다. 방법 (을)를 선택했을 때 중요한 것은, 미래의 응용 프로그램은 밀접하게 고려되어야한다F 특정 방법은 세포 성분에 유해 할 수 있으므로, 인간의 샘플을 처리하고 다른 사람을 살려주는 동안 신호 전달 경로. 인체 조직을 포함하는 모든 연구, 규제 문제를 해결해야합니다. 터스 키기과 벨몬트 보고서 이후, 생물 의학 연구는 고유의 위험은 종종 피할 수없는 윤리적 딜레마 (6)의 결과와 관련되었다는 사실의 성장 수용이 있었다. 국가 표준의 필요성을 인식하고, 연방 정부는 벨몬트 보고서의 원칙을 유지 (명, 선행, 정의에 대한 존중)하는 수단으로 임상 시험 심사 보드 (IRBs를) 만들었습니다. 모든 기관의 IRB는 연구 참가자를 보호 할 책임이 있습니다 의사, 연구자 및 지역 사회 구성원의위원회이다. 그것은 자발적 동의는 생물 의학 연구의 모든 연구 참가자를 얻을 수 있어야하고,이 동의는 동의 FO에 설명하는 것이<html> RM. 동의서 프로세스 정보 결정은 연구에 등록 또는 가입 상태를 유지할지 여부에 제조 될 수 있도록 참가자에게 적절한 정보를 제공하는 것을 목적으로한다. 이와 관련, 동의서 문서는 좋은 가독성이 있어야 쉽게 표적 집단에 의해 (6 일 ~ 8 학년 읽기 수준) 이해 될 수있다 언어로 작성되어야한다. 강압 또는 부당한 영향의 가능성을 최소화 할 수 있어야하고, 피사체가 참여를 고려할 충분한 시간이 주어져야한다. 참가자는 처벌하지 않고 연구의 과정에서 모든 단계에서 동의를 철회 할 수있는 권리를 행사할 수 있어야합니다. 자발적인 동의서는 연구 주체의 참여를위한 필수 전제 조건이며 또한 7 법적으로 유효하다. 인간의 보호를위한 규정에 따라 과목 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), 연구 참가자는 연구의 목적을 통보해야하며, 연구에 참여 절차 참여에 대한 대안, 사회에 대한 가능성이 개인에게 연구의 모든 예측 가능한 위험과 불편 (뿐만 아니라 신체적 상해뿐만 아니라 수, 심리적, 사회적, 경제적 피해, 불편 함, 또는 불편 포함), 혜택, 피사체가 참여 할 것으로 예상되는 시간의 길이, 사람은 참여가 자발적임을 나타내는 문, 질문에 대한 또는 연구 관련 부상이나 응급 상황에 대한 답을 문의하고 참여하는 것을 거부는 정기적으로 임상 치료에 타협으로 어떤 결과 또는 혜택을 상실하지 않습니다 참가자가 다른 권리가 있음을 기밀성과에서 철수하는 오른쪽에있는 피사체의 권리에 관한 마지막으로 문을 그 / 그녀의 진단의 결과로 수신하고어떤 결과없이 언제든지 연구. 연구의 과정에서 동의를 철회 참가자의 조직 표본 뱅크해서는 안 즉시 소진해야합니다. 동의서의 하나 또는 그 이상의 요소의 면제는 실질적으로 필요한 요소 또는 필수 요소가 적용되지 않습니다 연구에 대한 변경없이 할 수없는 몇 가지 연구 프로젝트에 대한 IRB에서 얻을 수있다. 큰 관심은 데이터의 기밀성을 보장하기 위해주의해야합니다. 건강 보험 양도 및 책임에 관한 법률 (HIPAA)을 사용하거나 참가자의 서면 동의없이 &quot;보호 된 건강 정보&quot;(PHI)를 공개 방지 연방법입니다. PHI 포함하지만 의료 정보 전송되거나 유지 어떠한 형태 또는 매체와 9 개인을 식별하는 데 사용될 수있는 필드들에 한정되지 않는다. 이 작품을 통해 우리는 tissu 과정에서 지켜야하는 프로토콜을 간략하게 설명하는 것을 목표로전자 처리 - 조달을 포함하고, 저장하고 조직 추출시에받는 응력으로 인해 발생할 수 편향을 최소화하기 위하여 이러한 엄격한 가이드 라인을 다음의 중요성을 강조한다. 독자가 무엇을 분석 (들)에 가장 적합한 자신의 요구에 자격을 갖춘 판단을 할 수 있도록 우리는 또한 다운 스트림 분석 또는 표본에 대해 수행 할 수있는 분석 (그림 1)에 대한 간략한 개요를 제공하기 위해 노력하고 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel disposable scalpels</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>58931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-stabilizing solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MAX-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>StatLab Medical Products</td>
			<td>28600-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Containers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-032-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature solution (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m cell strainers</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead stain solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

working with human tissues for translational cancer research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

<html> 아래에 표시된 결과는 처리 흑색 종 종양에 대한 광범위한 면역 표현형 유동 세포 계측법 게이팅 전략을 도시한다. 염색의 날, 조직 샘플은 225 RPM의 회전하에 37 ℃에서, 소화 I 콜라게나 제 및 60 분간의 DNase I 인큐베이션 균질화 하였다. 소화 후, 세포 현탁액은 파편을 제거하기 위해 70 μm의 세포 여과기를 통해 여과하고, 세포를 면역 세포 계측법 표현형에 대한 항체의 형광 표지 된 흐름으로 ...

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Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

번역 상 암 연구를위한 인체 조직에 대한 작업

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K 조회수.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

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Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

종합 흉부 종양학 데이터베이스의 생성 - Translational 연구 도구

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

연구

의학

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Oncolytic 바이러스 살아있는 조직의 전의 VIVO 감염

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma and devastating tissue loss. Despite favorable and highly encouraging early and intermediate functional outcomes, rejection of the highly immunogenic skin component of a VCA and potential adverse effects of chronic multi-drug immunosuppression continue to hamper widespread clinical application of VCA. Therefore, research in this novel field needs to focus on translational studies related to unique immunologic features of VCA and to develop novel immunomodulatory strategies for immunomodulation and tolerance induction following VCA without the need for long term immunosuppression.
This article describes a reliable and reproducible translational large animal model of VCA that is comprised of an osteomyocutaneous flap in a MHC-defined swine heterotopic hind limb allotransplantation. Briefly, a well-vascularized skin paddle is identified in the anteromedial thigh region using near infrared laser angiography. The underlying muscles, knee joint, distal femur, and proximal tibia are harvested on a femoral vascular pedicle. This allograft can be considered both a VCA and a vascularized bone marrow transplant with its unique immune privileged features. The graft is transplanted to a subcutaneous abdominal pocket in the recipient animal with a skin component exteriorized to the dorsolateral region for immune monitoring.
Three surgical teams work simultaneously in a well-coordinated manner to reduce anesthesia and ischemia times, thereby improving efficiency of this model and reducing potential confounders in experimental protocols. This model serves as the groundwork for future therapeutic strategies aimed at reducing and potentially eliminating the need for chronic multi-drug immunosuppression in VCA.

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascularized Composite Allotransplantations (VCA) have become a clinical reality. However, broad clinical application of VCA is limited by chronic multi-drug immunosuppression. The authors present a reliable and reproducible large animal model to translate novel immunomodulatory strategies that can minimize or potentially eliminate the need of immunosuppression in VCA.

번역 상 혈관을 조성한 복합 동종 이식 (VCA) 연구를위한 수정 된 이소성 돼지 뒷다리 이식 모델

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

작은 분자 CLT1 펩타이드 표적 조영제와 전립선 암의 MR 분자 영상

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...