Burada kullandığımız yöntem, oligonükleotidin tek duvarlı karbon nanotüp ile paketletilmeye yardımcı olabilir, ki bu ilaç teslimatı için yeni bir nanopartikül türüdür. Bu tekniğin en önemli avantajı, oligonükleotid ilaçların in vivo hücrelere daha verimli bir şekilde ulaştırılmasıdır. Bu tekniğin etkileri multipl miyelom araştırmasına kadar uzanır, çünkü oligonükleotid ilaçların teslimini iyileştirmek için nanopartikül madde yi piyasaya sürükler.
Bu yöntem sayesinde multipl miyelom tedavisi hakkında bilgi sağlayabilir. Aynı zamanda diğer hastalıklara uygulanabilir ve proteinler ve küçük moleküller gibi diğer kargo ile konjuge. İlk olarak, bir miligram tek duvarlı karbon nanotüpler, beş miligram DSPE-PEG 2000 amin ve 20 mililitrelik cam sintillasyon şişesinde beş mililitre sterilize nükleaz içermeyen suyu karıştırın.
Oda sıcaklığında bir saat boyunca 90 watt güç seviyesinde bir su banyosu sonicator şişe sonicate. Sonication sonra, altı saat boyunca 24, 000 kez g şişe santrifüj. Sonra supernatant çözüm toplamak.
100 kilodalton moleküler ağırlık kesme santrifüj filtre cihazı ve ardından steril çekirdeksiz su dört mililitre tek duvarkarbon nanotüp çözeltisi bir mililitre ekleyin. Fazla amini çıkarmak için oda sıcaklığında 4,000 kez g'de 10 dakika santrifüj. Amin fonksiyonlu tek duvarlı karbon nanotüp 450 mikrolitre Sulfo-LC-SPDP 0,5 miligram ekleyin.
Sonra 10x PBS 50 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat kuluçka. Daha sonra, 100 kilodalton moleküler ağırlık kesme santrifüj filtre cihazı, nükleaz içermeyen su dört mililitre takip reaksiyon karışımı ekleyin. Fazla Sulfo-LC-SPDP'yi çıkarmak için numuneyi oda sıcaklığında 4,000 kez g'de 10 dakika santrifüj edin.
Filtrede bırakılan Sulfo-LC-SPDP ile işlenmiş amin tek duvarlı karbon nanotüp çözeltisini toplayın ve daha önce hazırlanmış 500 mikrolitre anti-MALAT1-Cy3 çözeltisi ile seyreltin. Sonra numuneyi bir gecede dört derecede kuluçkaya yatırın. Karşılaştırmanın en iyi sonuçlarını elde etmek için, 14 fareyi her grupta yedi tane olan ve her grupta aynı erkek-kadın oranına sahip deneme veya kontrol gruplarına rastgele yerleştirin.
Daha sonra, operasyon tezgahını temizleyin ve %70 etil alkolle sterilize edin. Kuyruk damarının görünmesine yardımcı olmak için farelerden birini ısıtmak için Bir ısıtma lambası kullanın. Fareyi kuyruk enjeksiyonu engelleyiciyle düzgün bir şekilde dizginle.
MM.1S-luc/mCherry hücrelerini kuyruk damarına 50 mikrolitre PBS enjekte edin. Enjeksiyon bölgesine 30 saniye boyunca alkol bezi ile basın. Sonra enjekte edilen fareyi işaretleyin ve temiz bir kafese geri döndürün.
Yedinci gün, MM1S hücre enjeksiyonundan sonra, farenin kuyruk damarına tek duvarlı karbon nanotüp anti-MALAT1 içeren 50 mikrolitre PBS enjekte edin. Daha sonra 30 saniye boyunca bir alkol bezi ile enjeksiyon sitesine basın. Kuyruktaki lokal kanamayı ve farenin genel davranışını bir dakika boyunca gözlemleyin ve sonra temiz bir kafese geri döndürün.
Enjeksiyonların iyi tolere edildiğinden emin olmak için kafesi rafa geri vermeden önce enjekte edilen tüm fareleri tekrar gözlemleyin. Diseksiyondan önce her fareyi tartın. Bir kan hücresi sayAcı makinesi tarafından yapılan tam bir kan sayımı tahlili için kalpten periferik kan toplamak.
Sonra, kemik iliği, dalak, lenf düğümü, böbrek ve görünür metastazı olan doku dokuları toplamak. Kemik iliği örneklerinden RNA ve protein ayıklayın. Formalin kalan tüm dokuları düzeltin.
24 saatlik fiksasyondan sonra kemik örneklerini kireçlenme için beş gün boyunca 0,5 molar EDTA çözeltisine batırın. Daha sonra tüm numuneleri uzun süreli depolama için %75 etil alkole batırın. QRT PCR sonuçları anti-MALAT1 gapmeR DNA'nın MALAT1 ekspresyonunu düşürüp H929 ve MM.1S hücrelerinde önemli ölçüde apoptoza neden olduğunu göstermiştir.
Tek duvarlı karbon nanotüp anti-MALAT1-Cy3 MM hücrelerinin çekirdeğine teslim edildi ve hem H929 hem de MM.1S hücrelerinde endojen MALAT1 seviyesini önemli ölçüde bastırdı. BMEC-1 hücresinin canlılığı, tek duvarlı karbon nanotüp anti-MALAT1-Cy3 tedavisinden veya farklı dozlarda ve zaman noktalarında kontrol edildikten sonra anlamlı bir fark yaratmaz. Bu tek duvarlı karbon nanotüp anti-MALAT1-Cy3 toksisitesi yüksek dozda normal hücrelere sınırlı ve kabul edilebilir toksisite olduğunu gösterir.
Bir insan MM-yaygın fare modeli in vivo tek duvarlı karbon nanotüp anti-MALAT1 tedavi etkilerini değerlendirmek için kurulmuştur. Tek duvarlı karbon nanotüp anti-MALAT1 tedavi grubundaki farelerin luciferon sinyalleri, 21 günlük tedaviden sonra kontrole göre oldukça düşüktü. Bu sonuçlardan, intravenöz enjeksiyon yoluyla tek duvarlı karbon nanotüp anti-MALAT1 tedavisinin tümör hücrelerine anti-MALAT1 oligolarını etkili bir şekilde verebileceği sonucuna varılmıştır.
Tek duvarlı karbon nanotüp anti-MALAT1 enjeksiyonunun fareler için güvenli bir tedavi olduğunu belirten tedavinin önemli bir yan etkisi gözlenmemiştir. Bu prosedürü denerken, hücre molekülü bileşiminin oligonükleotid ilaçların doğumunu, verimliliğini ve terapötik etkisini etkileyeceğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, proteinlerin veya küçük moleküllerin konjugasyonu gibi diğer yöntemler ek soruları cevaplamak için yapılabilir.
Diğer ilaçlar sunmak için tek duvarlı karbon nanotüpler kullanarak gibi.
