Bölümlere ayrılmış mikroakışkan cihazlar nöronların son derece polarize formunda incelenmesini sağlar. Bu cihazlar hem temel hem de çevirisel nörolojik araştırmalar için etkilidir. Bu protokol, insan kök hücrelerinden farklı nöronları bölümlere ayırmak için döngüsel olefin kopolimer yongalarının nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.
Bu COC yongaları PDMS çok bölmeli cihazlar üzerinde farklılaştırılmış nöronların sağlıklı kültürler üretmek. Bu protokolde, NIH onaylı H9 kök hücre hattından farklı nöron kültürünü gösteriyoruz. Benzer prosedürler mIPSCs gelen nöronlar ayırt etmek için kullanılabilir.
Çok bölmeli talaşlar ekstra nemlendirme ile ikincil çevreleme içine yerleştirilmelidir. Çok bölmeli yongaların kanalları bir ön kat çözeltisi ile doldurulmalı ve pbs ile temizlenmelidir. Başlamak için, hücre kültürü sınıf distile su poli-L-ornitin eritmek için yonga başına çözelti 600 mikrolitre yapmak.
Pipet ucunun kanal açılışından uzakta olduğundan emin olmak için kuyulardan kalan PBS'yi aspire edin. Sağ üst kuyuya 150 mikrolitre poli-L-ornitin çalışma çözeltisi yükleyin. 90 saniye bekleyin ve sağ alt kuyuya çözeltinin 150 mikrolitre ekleyin.
Beş dakika bekleyin ve sol kuyular için çözüm ile yükleme işlemini tekrarlayın. Daha sonra, bir gecede dört derece santigrat talaş ile nemlendirici tepsi yerleştirin. Petri kabı kullanıyorsanız, Parafilm ile sarın ve bir gecede dört derece santigrat yerleştirin.
Daha sonra, pipet ucunun kanal açılışından uzağa yerleştirilmesini sağlayarak çözeltiyi kuyulardan aspire edin. Ve 150 mikrolitre steril su her iki kez sağ ve sol kuyular yükleme tekrarlayın. Laminin çalışma çözümlerini hazırlayın.
Sağ ve sol kuyuları her laminin çalışma çözeltisinin 150 mikrolitresiyle yükleyin. Çipi tepside 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Kalsiyum ve magnezyum olmadan PBS ile çip durun.
PBS'nin her biri 150 mikrolitre ile sağ ve sol kuyuları yükleyin. Beş dakika bekleyin. PBS'yi kuyulardan aspire edin ve çipi NSC ortamlarıyla durula.
NSC ortamının her birini 150 mikrolitre ile sağ ve sol kuyuları yükleyin. Çipi bir gecede tepsiye 37 derece santigrat dereceden %5 CO2 ile tüpolarak yerleştirin ve çipi ön koşullandırmaya hazırlayın. İnsan nöral kök hücrelerini çok bölmeli çipe tohumlamak için önce hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu say.
Sonra, kuyulardan medya aspire. Pipet sağ üst iyi hücre çözeltisi beş mikrolitre, sağ alt kuyuya beş mikrolitre takip. Hücrelerin kanala girip girmediğini kontrol etmek için mikroskop kullanın.
Hücrelerin çipin altına yapışması için beş dakika bekleyin. Pipet yaklaşık 150 mikrolitre NSC medya sağ ve sol kuyular. Uygun bir nemlendirilmiş konteyner içinde%5 CO2, 37 santigrat derece kuluçka.
48 saat sonra, wells NSC medya aspire ve her üst kuyu ve her alt iyi 150 mikrolitre ekleyerek nöral farklılaşma ortamı ile değiştirin. %5 CO2 içindeki kültür nöronları, nemlendirici tepsi içinde 37 santigrat derece kuvöz. Kalan sinirsel diferansiyasyon ortamını aksonal bölmeden çıkarın ve bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
37 santigrat derecede saklayın. Isıtılmış ortam 150 mikrolitre ile virüs çözeltisi 50 mikrolitre karıştırın. Pipet 100 mikrolitre karışımın her iki kuyuya akson bölmesi.
37 derecelik bir kuluçka makinesinde iki saat kuluçkaya yat. Virüs içeren medyayı geri çekin ve imha edin. Bir akson bölmesine taze ortamın 75 mikrolitresini hafifçe pipetle ve medyanın kanaldan diğer akson kuyuya akmasını sağlar.
Bu işlemi bir kez tekrarlayın. Son olarak, akson bölmesini kaydedilmiş ortamla doldurun ve çipi kuvöze aktarın. Farklılaşma ortamı ile çip bir hafta sonra, insan nöral kök hücreleri nöronlar içine farklılaşmış, bağlı ve eşit somatik bölmesi içinde dağıtılır.
Buna karşılık, PDMS cihazlarındaki nöronlar beş gün gibi erken bir sürede biraraya toplanmış ve farklılaşma ortamının eklenmesinden sonra hücre sağlığının tehlikeye girmelerine yol açtı. Etiketli nöronların ve dendritik dikenlerin mCherry floresan proteini ile görüntülenmesi, çipler içinde farklılaşan NSC kaynaklı nöronların olgun sinapslar oluşturduğunu göstermiştir. Nöronlar uyarıcı sinaptik belirteç için etiketlendi, vGlut1.
İmmünoboyama sonuçları viral etiketli nöronların vGlut1 ile birlikte lokalize olabileceğini göstermektedir, ve nörona özgü belirteç, Beta-tubulin üç. Viral olarak transeksiyonlanmış mCherry nöronlar önceden monte edilmiş çip içinde kurulan akson lokalize mikroortama projeksiyonları genişletir. Aksotomiden önce ve hemen sonra mCherry etiketli nöronların görüntüleri arasında yapılan karşılaştırmada tamamen kopmuş aksonların ortaya çıktı.
Aksotomi işlemi dışında kanalların sıvı yla dolu kaldığından emin olmak çok önemlidir. COC-kompartıman yongaları kullanımı kolaydır ve nöronal yaralanma, sinaptogenez, sinaptik plastisite ve hastalığın patofizyolojisi ile ilgili çok sayıda araştırma için kapıyı açabilir.
