Dispositivos microfluidos compartimentados permitem que os neurônios sejam estudados em sua forma altamente polarizada. Esses dispositivos são fundamentais para pesquisas básicas e translacionais de neurociência. Este protocolo descreve como usar chips ciclicos olefin copolímeros para compartimentar neurônios diferenciados das células-tronco humanas.
Esses chips COC produzem culturas mais saudáveis de neurônios diferenciados em relação a dispositivos multipartidárticos PDMS. Neste protocolo, demonstramos a cultura dos neurônios diferenciados da linha de células-tronco H9 aprovada pelo NIH. Procedimentos semelhantes podem ser usados para diferenciar neurônios dos mIPSCs.
Os chips multipartidários devem ser colocados em contenção secundária com umidificação extra. Os canais dos chips multipartidáridos devem ser preenchidos com uma solução de pré-revestimento e, em seguida, lavados com PBS. Para começar, dissolva a poli-L-ornithine na água destilada de grau de cultura celular para fazer 600 microliters de solução por chip.
Aspire o PBS restante dos poços, certificando-se de que a ponta da pipeta está longe da abertura do canal. Carregar 150 microliters de solução de trabalho poli-L-ornithine no poço superior direito. Aguarde 90 segundos e adicione 150 microliters da solução ao poço inferior direito.
Aguarde cinco minutos e repita o processo de carregamento com a solução para os poços esquerdos. Em seguida, coloque a bandeja do umidificador com chip a quatro graus Celsius durante a noite. Se usar uma placa de Petri, enrole-a com Parafilm e coloque-a a quatro graus Celsius durante a noite.
Em seguida, aspire a solução a partir dos poços, garantindo que a ponta da pipeta seja colocada longe da abertura do canal. E repita carregando os poços direito e esquerdo com 150 microliters cada um de água estéril duas vezes. Prepare a solução de trabalho laminin.
Carregue os poços direito e esquerdo com 150 microliters cada uma das soluções de trabalho laminina. Incubar o chip dentro da bandeja por duas horas a 37 graus Celsius. Enxágüe o chip com PBS sem cálcio e magnésio.
Carregue os poços direito e esquerdo com 150 microliters cada um de PBS. Espere cinco minutos. Aspire o PBS dos poços e enxágue o chip com mídia NSC.
Carregue os poços direito e esquerdo com 150 microliters cada um dos meios de comunicação NSC. Incubar o chip na bandeja durante a noite na incubadora Celsius de 37 graus com 5% de CO2 para pré-conditentar o chip. Para semear células-tronco neurais humanas no chip multipartidárido, primeiro conte a concentração celular usando um hemócito.
Então, aspirar a mídia dos poços. Pipeta cinco microliters da solução celular para o poço superior direito, seguido por cinco microliters para o poço inferior direito. Use um microscópio para verificar se as células entraram no canal.
Espere cinco minutos para as células aderirem ao fundo do chip. Pipeta aproximadamente 150 microliters de mídia NSC para os poços direito e esquerdo. Incubar a 5% de CO2, 37 graus Celsius dentro de um recipiente umidificado adequado.
Após 48 horas, aspire a mídia NSC dos poços e substitua-a por mídia de diferenciação neural adicionando 150 microliters a cada topo bem e cada fundo bem. Neurônios de cultura dentro de uma incubadora de 5%, 37 graus Celsius dentro de uma bandeja de umidificador. Remova a mídia de diferenciação neural restante do compartimento axonal e coloque-a em um tubo de centrífuga.
Armazene a 37 graus Celsius. Misture 50 microliters da solução do vírus com 150 microliters da mídia aquecida. Pipeta 100 microliters da mistura para ambos os poços do compartimento do axônio.
Incubar por duas horas dentro de uma incubadora Celsius de 37 graus. Retire e elimine a mídia que contém vírus. Pipeta suavemente 75 microliters da mídia fresca para um compartimento de axônio bem e deixe a mídia fluir através do canal para outro axônio bem.
Repita este processo uma vez. Por fim, encha o compartimento do axônio com a mídia salva e transfira o chip para a incubadora. Após uma semana no chip com a mídia de diferenciação, células-tronco neurais humanas se diferenciam em neurônios, anexadas e distribuídas uniformemente dentro do compartimento somático.
Em comparação, os neurônios em dispositivos PDMS agregados já em cinco dias após a adição de mídia de diferenciação, levando à saúde celular comprometida. A visualização de neurônios rotulados e espinhos dendríticos com proteína fluorescente mCherry mostrou que os neurônios derivados do NSC diferenciados dentro dos chips formam sinapses maduras. Os neurônios foram rotulados para o marcador sináptico excitatório, vGlut1.
Os resultados da imunossuagem mostram que neurônios rotulados viralmente poderiam co-localizar com vGlut1, e marcador específico de neurônios, Beta-tubulin três. Neurônios mCherry transduzidos viralmente estendem projeções em um microambiente localizado no axônio estabelecido dentro do chip pré-remontado. Uma comparação entre as imagens de neurônios rotulados por mCherry antes e imediatamente após a axotomia mostrou axônios completamente decepados.
É fundamental garantir que os canais permaneçam preenchidos com fluido, exceto ao realizar o procedimento de axotomia. Chips compartimentados com COC são fáceis de usar e podem abrir a porta para inúmeras investigações relacionadas a lesões neuronais, sinápgeno, plasticidade sináptica e fisiopatologia da doença.
