Разрозненные микрофлюидные устройства позволяют изучать нейроны в их сильно поляризованной форме. Эти устройства играют важную роль как для фундаментальных, так и для трансляционных исследований в области неврологии. Этот протокол описывает, как использовать циклические чипы олефин кополитера для разобщения нейронов, дифференцированных от стволовых клеток человека.
Эти микросхемы COC производят более здоровую культуру дифференцированных нейронов по многокоммерьевым устройствам PDMS. В этом протоколе мы демонстрируем культуру нейронов, дифференцированных от одобренной NIH линии стволовых клеток H9. Аналогичные процедуры могут быть использованы для дифференцировать нейроны от mIPSCs.
Многокоммекторные чипы должны быть помещены во вторичное сдерживание с дополнительной увлажнением. Каналы многокомипных чипов должны быть заполнены прекоутным раствором, а затем промыты PBS. Для начала растворите поли-L-орнитин в клеточной культуре сорта дистиллированной воды, чтобы сделать 600 микролитров раствора на чип.
Аспирировать оставшиеся PBS из скважин, убедившись, что наконечник пипетки находится вдали от открытия канала. Загрузите 150 микролитров поли-L-орнитинового рабочего раствора в правом верхнем правом направлении. Подождите 90 секунд и добавьте 150 микролитров раствора в нижнюю правую колодец.
Подождите пять минут и повторите процесс загрузки с раствором для левых скважин. Затем поместите лоток увлажнителя с чипом при четырех градусах по Цельсию на ночь. При использовании чашки Петри, оберните его с Parafilm и поместите его на четыре градуса по Цельсию на ночь.
Далее, аспирировать раствор из скважин, гарантируя, что кончик пипетки помещается от открытия канала. И повторная загрузка правой и левой скважин по 150 микролитров каждая из стерильной воды в два раза. Приготовьте рабочий раствор ламинина.
Загрузите правую и левую скважины 150 микролитров каждый из ламинина рабочего раствора. Инкубировать чип в лоток в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию. Промыть чип с PBS без кальция и магния.
Загрузите правую и левую скважины 150 микролитров каждый из PBS. Подожди пять минут. Аспирировать PBS из скважин и промыть чип с НСК СМИ.
Загрузите правую и левую скважины 150 микролитров каждая из медиа-НСПК. Инкубировать чип в лоток на ночь в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%CO2 для предварительного состояния чипа. Чтобы засеять нервные стволовые клетки человека в многокомбинный чип, сначала подсчитайте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра.
Затем, аспирировать средства массовой информации из скважин. Pipette пять микролитров клеточного раствора в правом верхнем правом хорошо, а затем пять микролитров в правом нижнем хорошо. Используйте микроскоп, чтобы проверить, что клетки вошли в канал.
Подождите пять минут, пока клетки будут придерживаться нижней части чипа. Пипетт около 150 микролитров НСК СМИ вправо и влево скважин. Инкубационный при 5%CO2, 37 градусов по Цельсию в подходящем увлажненные контейнеры.
После 48 часов, аспирировать НСК сми из скважин и заменить его нервной дифференциации средств массовой информации, добавив 150 микролитров для каждой верхней хорошо, и каждый нижний хорошо. Культурные нейроны в пределах 5%CO2, 37 градусов по Цельсию инкубатор в лоток увлажнителя. Удалите оставшиеся нейронные средства дифференциации из аксонального отсека и поместите его в центрифугу.
Хранить при 37 градусах по Цельсию. Смешайте 50 микролитров раствора вируса со 150 микролитров разогретого мультимедиа. Пипетт 100 микролитров смеси к обеим скважинам аксонового отсека.
Инкубировать в течение двух часов в пределах 37 градусов по Цельсию инкубатора. Изымать и избавляться от вирусосодержащих средств массовой информации. Аккуратно пипетки 75 микролитров свежих средств массовой информации в один аксон отсек хорошо, и пусть средства массовой информации течь через канал в другой аксон хорошо.
Повторите этот процесс один раз. Наконец, заполните аксон отсек с сохраненных средств массовой информации, и передать чип в инкубатор. После одной недели в чипе с дифференциацией средств массовой информации, человеческие нервные стволовые клетки дифференцированы в нейроны, прилагается и равномерно распределены в соматический отсек.
Для сравнения, нейроны в устройствах PDMS агрегированы уже через пять дней после добавления дифференциации средств массовой информации, что приводит к угрозе здоровья клеток. Визуализация помеченных нейронов и дендритных шипов с флуоресцентным белком mCherry показала, что нейроны, полученные из НСК, дифференцированные в пределах чипов, образуют зрелые синапсы. Нейроны были помечены для возбуждающей синаптический маркер, vGlut1.
Иммуностимуляторные результаты показывают, что вирусно помеченные нейроны могут со-локализоваться с vGlut1, и нейрон-специфический маркер, Бета-тубулин три. Вирусно трансдицированные нейроны mCherry расширяют проекции в локализованную аксоном микроокниронию, установленную в заранее собранном чипе. Сравнение изображений mCherry помечены нейронов до и сразу после аксотомии показали полностью разорваны аксоны.
Очень важно, чтобы убедиться, что каналы остаются заполнены жидкостью, за исключением при выполнении процедуры аксотомии. COC-разобщенные чипы просты в использовании и могут открыть дверь для многочисленных исследований, связанных с повреждением нейронов, синаптогенезом, синаптической пластичностью и патофизиологией болезни.
