Los dispositivos microfluídicos compartimentados permiten estudiar las neuronas en su forma altamente polarizada. Estos dispositivos son fundamentales para la investigación de neurociencia básica y traslacional. Este protocolo describe cómo utilizar chips cíclicos de copolímero de olefina para compartimentar las neuronas diferenciadas de las células madre humanas.
Estos chips COC producen cultivos más saludables de neuronas diferenciadas sobre dispositivos multicompartimentales PDMS. En este protocolo, demostramos el cultivo de neuronas diferenciadas de la línea de células madre H9 aprobada por NIH. Procedimientos similares se pueden utilizar para diferenciar las neuronas de los mIPSC.
Las virutas multicompartimento deben colocarse en contención secundaria con una humidificación adicional. Los canales de los chips multicompartimentales deben llenarse con una solución de precapa y luego lavarse con PBS. Para empezar, disolver la poli-L-ornitina en agua destilada de grado de cultivo celular para hacer 600 microlitros de solución por chip.
Aspirar el PBS restante de los pozos, asegurándose de que la punta de la pipeta esté lejos de la abertura del canal. Cargue 150 microlitros de solución de trabajo de poli-L-ornitina en el pozo superior derecho. Espere 90 segundos y añada 150 microlitros de la solución al pozo inferior derecho.
Espere cinco minutos y repita el proceso de carga con la solución para los pozos izquierdos. A continuación, coloque la bandeja del humidificador con chip a cuatro grados centígrados durante la noche. Si usa un plato de Petri, envuélvalo con Parafilm y colóquelo a cuatro grados centígrados durante la noche.
A continuación, aspirar la solución de los pozos, asegurándose de que la punta de la pipeta se coloca lejos de la abertura del canal. Y repetir la carga de los pozos derecho e izquierdo con 150 microlitros cada uno de agua estéril dos veces. Prepare la solución de trabajo de laminin.
Cargue los pozos derecho e izquierdo con 150 microlitros cada una de las soluciones de trabajo de laminin. Incubar el chip dentro de la bandeja durante dos horas a 37 grados centígrados. Enjuague el chip con PBS sin calcio ni magnesio.
Cargue los pozos derecho e izquierdo con 150 microlitros cada uno de PBS. Espera cinco minutos. Aspirar el PBS de los pozos y enjuagar el chip con medios NSC.
Cargue los pozos derecho e izquierdo con 150 microlitros cada uno de los medios NSC. Incubar el chip en la bandeja durante la noche en la incubadora de 37 grados Celsius con 5%CO2 para pre-condicionar el chip. Para sembrar células madre neurales humanas en el chip multicompartimental, primero cuente la concentración celular usando un hemocitometómetro.
Entonces, aspirar los medios de los pozos. Pipetear cinco microlitros de la solución celular al pozo superior derecho, seguido de cinco microlitros en el pozo inferior derecho. Utilice un microscopio para comprobar que las células han entrado en el canal.
Espere cinco minutos para que las células se adhieran a la parte inferior del chip. Pipeta aproximadamente 150 microlitros de medios NSC a los pozos derecho e izquierdo. Incubar a 5%CO2, 37 grados Celsius dentro de un recipiente humidificado adecuado.
Después de 48 horas, aspirar medios NSC de los pozos y reemplazarlo con medios de diferenciación neuronal mediante la adición de 150 microlitros a cada pozo superior y cada pozo inferior. Neuronas de cultivo dentro de una incubadora de 5%CO2, 37 grados Celsius dentro de una bandeja humidificadora. Retire el medio de diferenciación neuronal restante del compartimiento axonal y colóquelo en un tubo centrífugo.
Almacenar a 37 grados centígrados. Mezclar 50 microlitros de la solución antivirus con 150 microlitros de los medios calentados. Pipetear 100 microlitros de la mezcla a ambos pozos del compartimiento del axón.
Incubar durante dos horas dentro de una incubadora de 37 grados Celsius. Retirar y eliminar los medios que contienen virus. Pipetee suavemente 75 microlitros de los medios frescos a un compartimiento de axón bien y deje que el medio fluya a través del canal hacia otro pozo de axón.
Repita este proceso una vez. Finalmente, llene el compartimiento del axón con el medio guardado, y transfiera el chip a la incubadora. Después de una semana en el chip con los medios de diferenciación, las células madre neurales humanas se diferenciaron en neuronas, unidas y distribuidas uniformemente dentro del compartimento somático.
En comparación, las neuronas en los dispositivos PDMS agregadas tan pronto como cinco días después de la adición de medios de diferenciación, lo que conduce a la salud celular comprometida. La visualización de neuronas etiquetadas y espinas dendríticas con proteína fluorescente mCherry mostró que las neuronas derivadas de NSC diferenciadas dentro de los chips forman sinapsis maduras. Las neuronas fueron etiquetadas para el marcador sináptico excitatorio, vGlut1.
Los resultados de la inmunosumanidad muestran que las neuronas etiquetadas viralmente podrían co-localizar con vGlut1, y marcador específico de la neurona, Beta-tubulina tres. Las neuronas mCherry transducidas viralmente extienden las proyecciones en un microambiente localizado en axón establecido dentro del chip premontado. Una comparación entre las imágenes de las neuronas etiquetadas con mCherry antes e inmediatamente después de la axotomía mostró axones completamente cortados.
Es fundamental asegurarse de que los canales permanezcan llenos de líquido, excepto cuando se realiza el procedimiento de axotomía. Las virutas compartimentadas cocalizadas son fáciles de usar y pueden abrir la puerta a numerosas investigaciones relacionadas con lesiones neuronales, sinaptogénesis, plasticidad sináptica y fisiopatología de la enfermedad.
