预组装塑料微流体芯片中人类干细胞衍生神经元的分段化

隔离微流体装置允许神经元以高度偏振的形式研究。这些设备有助于基础和转化神经科学研究。该协议描述了如何使用环烯烃共聚合物芯片来划分与人类干细胞区别的神经元。

这些 COC 芯片通过 PDMS 多节器器件产生更健康的分化神经元培养。在该协议中，我们演示了与NIH批准的H9干细胞系不同的神经元培养。类似的程序可用于区分神经元和mIPSC。

多隔间芯片必须放入二次密封中，并加湿。多节片芯片的通道必须用预涂溶液填充，然后用 PBS 冲洗。首先，在细胞培养级蒸馏水中溶解聚L-奥尼辛，使每个芯片的溶液得到600微升。

从油井中吸出剩余的 PBS，确保移液器尖端远离通道开口。在右上井中装载 150 微升聚 L- 奥尼辛工作溶液。等待 90 秒，在右下井中加入 150 微升溶液。

等待五分钟，用左井的溶液重复装载过程。然后，将加湿器托盘与芯片在四摄氏度过夜。如果使用培养皿，请用 Parafilm 包装，并过夜将其放在四摄氏度。

接下来，从油井中吸出溶液，确保移液器尖端远离通道开口。重复加载左右井与150微升每个无菌水两次。准备层压工作解决方案。

用每层压素工作溶液的 150 微升装载左右孔。在37摄氏度下在托盘内孵育芯片两小时。用PBS冲洗芯片，不带钙和镁。

用 PBS 的 150 微升加载右侧和左侧孔。等五分钟从油井中吸出 PBS，然后用 NSC 介质冲洗芯片。

每个 NSC 介质用 150 微升加载右侧和左侧孔。在 37 摄氏度的培养箱中用 5% CO2 孵育托盘中的芯片，以预化芯片。要将人类神经干细胞植入多极分芯片中，首先使用血细胞计计算细胞浓度。

然后，从井中吸出介质。将5微升的细胞溶液移到右上井，然后向右下井移5微升。使用显微镜检查细胞进入通道。

等待五分钟，让细胞粘附在芯片底部。左右井的 NSC 介质约有 150 微升。在合适的加湿容器内孵育5%CO2，37摄氏度。

48 小时后，从井中吸出 NSC 介质，并由神经分化介质代替，在每个顶部井和底部井中添加 150 微升。在加湿器托盘内 5%CO2、37 摄氏度的培养箱内培养神经元。从斧结室中取出剩余的神经分化介质，并将其放入离心管中。

储存在37摄氏度。将病毒溶液的 50 微升与 150 微升的加热介质混合。移液 100 微升的混合物到轴孔的两口井。

在37摄氏度的孵化器内孵育两小时。撤回并处置包含病毒的介质。轻轻移液75微升的新鲜介质到一轴孔隔间井，让介质流经通道进入其他轴孔井。

重复此过程一次。最后，用保存的介质填充轴孔隔间，然后将芯片转移到培养箱。在具有分化介质的芯片中一周后，人类神经干细胞分化成神经元，在体细胞室内均匀地连接和分布。

相比之下，PDMS设备中的神经元在添加分化介质后早在五天内聚集，导致细胞健康受损。使用mCherry荧光蛋白对标记神经元和树突状脊柱进行可视化，表明在芯片内分化的NSC衍生神经元形成成熟的突触。神经元被标记为兴奋突触标记，vGlut1。

免疫着色结果表明，病毒标记的神经元可以与vGlut1和神经元特异性标记，β-图布林三共同本地化。病毒性转导mCherry神经元将投影扩展为预组装芯片内建立的轴突定微环境。轴切除术之前和之后mCherry标记神经元的图像之间的比较显示轴突完全被切断。

确保通道保持充满液体至关重要，除非执行斧弓手术。COC-隔离芯片易于使用，可以打开大门，许多调查有关神经元损伤，突触发生，突触可塑性和疾病病理生理学。