구획화된 미세 유체 장치는 뉴런이 매우 편광된 형태로 연구될 수 있도록 합니다. 이 장치는 기본 및 번역 신경 과학 연구 모두에 대 한 도구. 이 프로토콜은 인간 줄기 세포와 분화된 뉴런을 구획화하기 위해 순환 올레핀 합합체 칩을 사용하는 방법을 설명합니다.

이 COC 칩은 PDMS 다중 구획 장치를 통해 차별화된 뉴런의 건강한 배양을 생성합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 NIH 승인 H9 줄기 세포주에서 분화된 뉴런의 문화를 보여줍니다. 유사한 절차는 mIPSCs에서 뉴런을 구별하기 위하여 이용될 수 있습니다.

멀티 컴파트먼트 칩은 추가 가습과 보조 봉쇄에 배치해야합니다. 멀티 컴파트먼트 칩의 채널은 프리코트 솔루션으로 채워진 다음 PBS로 플러시해야 합니다. 먼저, 세포 배양 등급 증류수에 폴리-L-ornithine를 용해하여 칩당 600 마이크로리터의 용액을 만듭니다.

나머지 PBS를 우물에서 흡인하여 파이펫 팁이 채널 열기에서 벗어났는지 확인합니다. 오른쪽 상단에 폴리 L-ornithine 작업 용액150 마이크로리터를 적재합니다. 90초 동안 기다렸다가 오른쪽 하단에 150마이크로리터를 추가합니다.

5분 간 기다렸다가 왼쪽 우물용 솔루션으로 로딩 프로세스를 반복합니다. 그런 다음 가습기 트레이에 칩을 칩으로 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 놓습니다. 페트리 접시를 사용하는 경우 파라필름으로 싸서 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 놓습니다.

다음으로, 우물에서 솔루션을 흡인하여 파이펫 팁이 채널 열기에서 멀리 배치되도록 합니다. 그리고 150 마이크로 리터의 멸균 물을 두 번 으로 오른쪽과 왼쪽 우물을 로드 반복합니다. 라미닌 작업 솔루션을 준비합니다.

각 라미닌 작동 솔루션150 마이크로리터로 오른쪽 및 왼쪽 우물을 로드합니다. 트레이 내에서 칩을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 칼슘과 마그네슘없이 PBS로 칩을 헹구는 다.

PBS의 각 150 마이크로 리터와 오른쪽과 왼쪽 우물을로드합니다. 5분 간 기다립니다. 우물에서 PBS를 흡인하고 NSC 미디어와 칩을 헹구는.

NSC 미디어 각각 150마이크로리터로 오른쪽 과 왼쪽 우물을 적재합니다. 칩을 사전 컨디셔닝하기 위해 37도 섭씨 인큐베이터에서 칩을 1박 동안 배양합니다. 인간 신경 줄기 세포를 다중 구획 칩으로 종자하려면 먼저 혈종계를 사용하여 세포 농도를 계산합니다.

그런 다음 우물에서 미디어를 흡인합니다. 오른쪽 상단에 셀 용액의 파이펫 5 마이크로리터가 우측 상단에 5마이크로리터가 그 뒤를 잇고 오른쪽 하단에 5마이크로리터가 있습니다. 현미경을 사용하여 세포가 채널에 들어갔는지 확인합니다.

셀이 칩 의 바닥에 부착될 때까지 5분 간 기다립니다. 오른쪽과 왼쪽 우물에 NSC 미디어의 약 150 마이크로 리터. 적절한 가습 용기 내에서 섭씨 5% CO2, 섭씨 37도에서 배양합니다.

48시간 후, 우물에서 NSC 미디어를 흡인하고 각 상단에 150 마이크로리터를 추가하여 신경 분화 매체로 대체합니다. 배양 뉴런은 가습기 트레이 내에서 5% CO2, 섭씨 37도 인큐베이터 내에 있습니다. 축 구획에서 나머지 신경 분화 매체를 제거하고 원심분리기 튜브에 넣습니다.

섭씨 37도에 보관하십시오. 온난한 매체의 150 마이크로리터와 바이러스 용액의 50 마이크로리터를 혼합합니다. 배축실의 양웰에 혼합물의 파이펫 100 마이크로리터.

섭씨 37도 인큐베이터 내에서 2시간 동안 배양하십시오. 바이러스가 포함된 미디어를 철회하고 폐기합니다. 신선한 매체의 75 마이크로리터를 하나의 축소 구획에 부드럽게 피펫하고 미디어가 채널을 통해 다른 축축으로 잘 흐르게 합니다.

이 프로세스를 한 번 반복합니다. 마지막으로 축축구를 저장된 매체로 채우고 칩을 인큐베이터로 옮웁니다. 분화 매체를 가진 칩에서 1 주일 후에, 인간 신경 줄기 세포는 신경으로 분화하고, 부착하고 체세포 구획 내로 고르게 분배했습니다.

이에 비해 PDMS 장치의 뉴런은 분화 매체를 추가한 지 5일 만에 집계되어 세포 건강이 손상되었습니다. mCherry 형광 단백질을 가진 표지된 뉴런및 수지상 척추의 시각화는 칩 내에서 분화된 NSC 유래 뉴런이 성숙한 시냅스를 형성하는 것으로 나타났다. 뉴런은 흥분시냅스 마커, vGlut1에 대 한 표시 되었다.

면역 염색 결과는 바이러스성 표지된 뉴런이 vGlut1및 뉴런 특정 마커, Beta-tubulin 3와 공동 국소화할 수 있었다는 것을 보여줍니다. 바이러스적으로 변형된 mCherry 뉴런은 미리 조립된 칩 내에 설치된 축산 국산화 된 마이크로 환경으로 프로젝션을 확장합니다. 축 축 절제술 전후에 mCherry 표지 뉴런의 이미지 사이의 비교는 완전히 절단 축축을 보여 주었다.

축 절 절차를 수행 하는 경우를 제외 하 고 채널 유체로 가득 유지 다는 것이 중요 하다. COC 구획 칩은 사용하기 쉽고 뉴런 부상, 시냅토 발생, 시냅스 가소성 및 질병의 병리학과 관련된 수많은 조사에 문을 열 수 있습니다.