מכשירים מיקרופלואידיים ממודרים מאפשרים לנוירונים להיחקר בצורתם המקוטבת ביותר. מכשירים אלה הם אינסטרומנטליים למחקר מדעי המוח בסיסי ותרגום. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בשבבי קופולימר אולפין מחזוריים כדי למדר נוירונים המובדלים מתאי גזע אנושיים.
שבבי COC אלה מייצרים תרבויות בריאות יותר של נוירונים מובחנים על פני התקנים מרובי תאים של PDMS. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את תרבות הנוירונים המובדלים מקו תאי הגזע H9 שאושר על ידי NIH. הליכים דומים יכולים לשמש כדי להבדיל נוירונים מ mIPSCs.
השבבים מרובי התאים חייבים להיות ממוקמים בלימה משנית עם לחות נוספת. יש למלא את הערוצים של השבבים מרובי התאים בתת פתרון מעיל מקדים ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS. כדי להתחיל, להמיס פולי-L-ornithine בתרבות התא כיתה מים מזוקקים כדי להפוך 600 microliters של פתרון לכל שבב.
שאף את PBS הנותרים מן בארות, לוודא כי טיפ פיפטה הוא הרחק פתיחת הערוץ. טען 150 מיקרוליטרים של פתרון עבודה פולי-L-ornithine היטב הימנית העליונה. המתן 90 שניות והוסף 150 מיקרוליטרים של הפתרון לתחתון הימני היטב.
המתן חמש דקות וחזור על תהליך הטעינה עם הפתרון ל בארות השמאליות. לאחר מכן, מניחים את מגש מכשיר האדים עם שבב בארבע מעלות צלזיוס לילה. אם משתמשים בצלחת פטרי, עוטפים אותה בפרפילם וממקמים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
לאחר מכן, שאף את הפתרון מה בארות, להבטיח כי טיפ פיפטה ממוקם הרחק פתיחת הערוץ. וחזרה על טעינת בארות ימין ושמאל עם 150 מיקרוליטרים כל אחד מהמים הסטריליים פעמיים. הכן את פתרון העבודה של למינין.
לטעון את בארות ימין ושמאל עם 150 microliters כל אחד פתרון העבודה למינין. דגירה השבב בתוך המגש במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. שוטפים את השבב עם PBS ללא סידן ומגנזיום.
טען את בארות ימין ושמאל עם 150 microliters כל אחד PBS. חכה חמש דקות. שאפו את ה-PBS מה בארות ושטוף את השבב עם התקשורת של המל"ל.
טען את בארות ימין ושמאל עם 150 מיקרוליטרים כל אחד מהתקשורת של המל"ל. הדגירה את השבב במגש לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 כדי להתנות מראש את השבב. כדי לזרוע תאי גזע עצביים אנושיים לתוך השבב מרובה התאים, לספור תחילה את ריכוז התא באמצעות hemocytometer.
לאחר מכן, שאף את התקשורת מה בארות. פיפטה חמישה מיקרוליטרים של פתרון התא ל הבאר הימנית העליונה, ואחריו חמישה מיקרוליטרים ל הבאר הימנית התחתונה. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שתאים נכנסו לערוץ.
המתן חמש דקות עד שתאים ידבקו לתחתית השבב. פיפטה כ-150 מיקרוליטרים של תקשורת המל"ל לאורך בארות ימין ושמאל. דגירה ב 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס בתוך מיכל לח מתאים.
לאחר 48 שעות, שאף את התקשורת של המל"ל מה בארות והחלף אותה במדיה של התברואה עצבית על ידי הוספת 150 מיקרוליטרים לכל באר תחתית ולכל באר תחתונה. תאי עצב תרבותיים בתוך חממה של 5%CO2, 37 מעלות צלזיוס בתוך מגש אדים. מוציאים את אמצעי ההבחנה העצבית הנותרים מהמדור האקסונאלי וממקם אותו בצינור צנטריפוגה.
יש לאחסן ב-37 מעלות צלזיוס. מערבבים 50 מיקרוליטרים של פתרון הנגיף עם 150 מיקרוליטרים של המדיה החמה. פיפטה 100 מיקרוליטרים של התערובת לשתי בארות תא האקסון.
אינקובט למשך שעתיים בתוך חממה של 37 מעלות צלזיוס. לסגת ולהיפטר מדיה המכילה וירוסים. בעדינות pipette 75 microliters של המדיה הטרייה לתא אקסון אחד היטב ולתת התקשורת לזרום דרך הערוץ לתוך אקסון אחר היטב.
חזור על תהליך זה פעם אחת. לבסוף, מלאו את תא האקסון במדיה השמורה והעברו את השבב לאנקובטור. לאחר שבוע בשבב עם אמצעי ההבחנה, תאי גזע עצביים אנושיים נבדלו לנוירונים, מחוברים ומופצים באופן שווה בתוך התא סומטי.
לשם השוואה, נוירונים במכשירי PDMS מצטברים כבר חמישה ימים לאחר הוספת מדיה ההידול, המוביל לבריאות התא נפגע. הדמיה של נוירונים מסומנים וקוצים דנדריטיים עם חלבון פלואורסצנטי mCherry הראה כי נוירונים שמקורם ב- NSC מובחנים בתוך השבבים יוצרים סינפסות בוגרות. נוירונים תויגו עבור סמן סינפטי סינפטי סינפטי סינפסיה סינפטית, vGlut1.
תוצאות immunostaining מראות כי נוירונים שכותרתו ויראלית יכול במשותף לוקליזציה עם vGlut1, ו סמן נוירון ספציפי, בטא-tubulin שלוש. נוירונים mCherry מתמר באופן ויראלי להרחיב את התחזיות לתוך microenvironment מקומי אקסון הוקמה בתוך השבב שהורכב מראש. השוואה בין התמונות של mCherry שכותרתו נוירונים לפני ומיד לאחר אקסוטומיה הראה אקסונים מנותקים לחלוטין.
זה קריטי כדי לוודא כי הערוצים להישאר מלא נוזלים למעט בעת ביצוע הליך האקסוטומיה. שבבים ממודרים COC קלים לשימוש והוא יכול לפתוח את הדלת חקירות רבות הקשורות לפציעה עצבית, synaptogenesis, פלסטיות סינפטית, ופתופיזיולוגיה של המחלה.
