Sunulan protokol, çevrede uzun süre var olabilecek proteinlerin trans ve çok nesilli etkileri üzerine çalışmaları kolaylaştıracaktır. Trans ve çok nesilli etkileri incelemek için zaman ve çabadan tasarruf etmek için hermafrodit olarak 99,5 ile serbest yaşam nematod istihdam ettik. Bu teknik, son ilaçların uzun vadeli etkilerini göstermek için kullanılabilir, çünkü mevcut protokoldeki nematod birçok konservatif mekanizmayı veya yolu insanlarla paylaşır.
Bu yöntem, kimyasalların potansiyel tehlikeleri hakkında geri bildirime ihtiyaç duydukları için farmasötik sentez ve çevre yönetimi alanlarına ışık verebilir. Bu yöntem suda toksisite daha fazla odaklanarak Daphnia magna uygulanabilir. Ayrıca Drosphila melanogaster daha fazla cinsiyet üzerindeki etkisini keşfetmek için.
Nesiller boyunca etkileri incelemenin zaman ve enerji tüketen bir şey olduğu fikrine takılıp kalır. İlk izlenimde korkma. Protokolü takip etmek size verimli bir sonuç kazandıracaktır.
Kültür E.coli için, pipet 200 mikrolitre bakteriyel süspansiyonlar içine 50 lb orta bir şişe içinde. Veya NGM agars küçük bir koloni almak ve LB orta yerleştirmek için bir aşıdöngü kullanın. Kültür C.elegans için, bir mikroskop altında, istifleme NGM agars daha önce hazırlanan nematodları saymak.
Sayı 2,000'e ulaştığında, NGM agarının 1/6'sını kesmek için steril bir uç kullanın ve bakteriyel çimenli yeni hazırlanmış NGM agarlarına aktarın. Sonraki kültür için 22 derece santigrat santigrat kuvözde NGM agars baş aşağı tutun. Yaklaşık 36 saat sonra, nematodlar gravid olur.
Steril santrifüj tüpler içine her NGM agar üzerinde gravid nematods ve yeni üretilen yumurta floş steril su iki mililitre kullanın. Nematodları yerleştirmek için tüpleri 30 dakika rafa yerleştirin ve sonra borulama ile süpernatantların %85'ini atın. Nematodların senkronizasyon için yeterince etkili olup olmadığına karar vermek çok önemlidir.
Aksi takdirde, yaş senkronizasyon işlemi boşuna olurdu. Peletleri yedi cilt sodyum hipoklorit çözeltisi ile karıştırın ve larvaları ve yetişkin nematodları lyse etmek için santrifüj tüplerini her iki dakikada bir 5-8 kez sallayın. Tüpleri 700 kez G'de 20 santigrat derecede üç dakika santrifüj edin ve sonra boruyu tutarak süpernatantları atın.
Yaş senkronize yumurtayıkamak için steril su beş hacimli pelet yeniden askıya. 20 santigrat derecede üç dakika için 700 kez G santrifüj. Steril su ile yıkamayı iki kez tekrarlayın.
Daha sonra, yaş senkronize yumurta ları yeniden askıya almak için tüplere bir hacim steril su ekleyin. Bakteriyel çim ile her yeni NGM agars üzerine elli mikro litre pipetleme tarafından yumurta süspansiyonlar dağıtın. NGM agars üst tarafında 20 derece santigrat antisul 30 dakika boyunca, su buharlaşmasını veya bakteriyel çim tarafından emilir izin tutun.
Sonra, NGM agars ters çevirin, sonraki kültür için, ve yumurta zamanı olarak zaman işareti. Yumurta saatinden 36 saat sonra nematodlar L3 larva evresine ulaşır. Santrifüj tüpler içine her NGM agar kapalı nematods floş steril su iki mililitre kullanın.
30 dakika yerleştikten sonra, iki saat boyunca bağırsaklarda gıda sindirmek için K Medium ile supernatants% 85 değiştirin. Sonra, supernatants atın. Sonraki deneyler için nematod süspansiyonları 100 mikrolitrede yaklaşık 200 nematod olarak ayarlamak için K Medium'u kullanın.
Kenar efektlerini önlemek için, 96 kuyulu steril bir mikroplakanın orta alanında, 10 kuyuya 10 0 mikrolitre hazırlanmış kontrol veya kimyasal çözelti ekleyin, altı grupta kopyalandığı gibi. 60 kuyunun her birine hazırlanan nematod K Medium'un 100 mikrolitresini ekleyin. Saati T0 olarak işaretleyin. Pozlamayı 24 ila 96 saat boyunca gerçekleştirin.
Pozlama sonra, altı 1,5 mililitre santrifüj tüpler içine, her gruptaki beş kuyudan nematod toplamak için bir pipet kullanın. 30 dakika nematodlar yerleşmek ve sonra supernatants atmak için pipet. Alttaki nematodları bir mililitre steril su ile yıkayın.
Nematodları 30 dakikalığına halledin. Süpernatantları atın ve f0 olarak işaretlenmiş açıkta kalan üst neslin gösterge ölçümleri için alttaki nematodları kullanın. Her grupta kalan beş kuyudan nematodları toplayın. Yerleşmek ve daha önce olduğu gibi nematodlar yıkayın.
Daha sonra, her tüpteki nematodları yeniden askıya almak için 100 mikrolitre steril su ekleyin ve nematod süspansiyonlarını bakteriyel çimenli yeni hazırlanmış üç NGM agars'a eşit olarak aktarın. Gravid olmak için 36 saat boyunca nematodları kuluçkaya yatırın ve daha önce olduğu gibi yaş senkronizasyonu yapın. NGM agarlarında senkronize yumurtaları bakteriyel çimlerle 36 saat kuluçkaya yattıktan sonra, nematodları altı santrifüj tüpüne boşaltın.
Bir mililitre steril su ile yerlebir edip yıkadıktan sonra, T1 olarak işaretlenmiş yavru neslinin gösterge ölçümleri için alttaki nematodları kullanın. 99 mililitre sıcak NGM agarını bir mililitre kontrol veya kimyasal çözeltiyle karıştırın. El yazmasına göre bakteri süspansiyonları ile agars hazırlandıktan sonra, biyo-güvenlik kabininde, petri kaplarının üst kapaklarını bir kenara koyun ve 15 dakika boyunca UV ışığına bakteri çim maruz. Pipet UV-tedavi agars üzerine yaş senkronize yumurta.
Ana nesil F0'ye maruz kalmanın başlangıcını sıfır gün olarak işaretleyin. Agarları üç gün boyunca 20 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, F0 etkilerini ölçmek için olgun nematodlar kullanın. Ayrıca, üçüncü gün, f0 olgun nematodları almak için bir halka içine bükülmüş bir insan yapımı fiber tel ile donatılmış bir cam çubuk kullanın, ve yeni UV tedavi NGM agars yüzeyine slayt.
Dördüncü gün, seçin ve NGM agars gelen olgun F0 nematods atın. Altıncı günde, endeks ölçümü için üç gün boyunca maruz kalma yaşamış F1 olgun nematodları kullanın. Bu protokolde, kadmiyum, bakır, kurşun ve çinkonun vücut bükme frekansı üzerindeki kuşak lar arası etkileri, nematod ebeveyni F0'deki inhibisyonların döllerinden daha az olduğunu göstermiştir, T1. Sülfametoksazolün nematod ömrü ve üreme üzerindeki çok nesilli kalıntı etkileri, üremenin mikrop-line maruziyetinde önemli ölçüde etkilendiğini ve toksisitelerin T3'ten T6 kuşağına kadar maruz kalan olmayan nesillerde devam ettiğini göstermiştir.
Lindane'nin nematod biyokimyasal ve genetik indeksler üzerinde çok nesilli maruziyet ve çok nesilli kalıntı etkileri, insülin sinyal regülasyonundaki bozukluklarla birlikte obezite etkileri göstermiştir. Ayrıca, sgk-1 ve akt-1 sinyalizasyonu arasındaki değişiklikler, farklı maruziyet nesillerinden nematodların tolerans ve kaçınma için farklı tepki stratejileri gösterdiğini göstermiştir. Her işlemden önce nematodların yaşam durumunu kontrol edin ve aşağıdaki adımları buna göre değiştirin.
Diğer etkileri, örneğin, kimyasalların obezite etkileri, daha fazla nesiller boyunca obezite artan yaygınlık cevap dahil edilebilir. Yönteme göre, diğer mekanizmalar araştırılabilir. Örneğin, nesiller arasında kalıtsal epigenetik sinyaller.
Klor çözeltileri güçlü oksidatif potansiyellere sahiptir ve cildin doğrudan temasından kaçınır.
