El protocolo presentado facilitará los estudios sobre los efectos trans y multigeneracionales de las proteínas que pueden existir durante mucho tiempo en el medio ambiente. Empleamos un nematodo de vida libre con 99,5 como hermafroditas para ahorrar tiempo y esfuerzo en el estudio de los efectos trans y multigeneracionales. Esta técnica se puede utilizar para demostrar los impactos a largo plazo de los fármacos finales porque el nematodo en el protocolo actual comparte muchos mecanismos o vías conservadoras con los seres humanos.
Este método puede proporcionar información sobre los campos de la síntesis farmacéutica y la gestión ambiental porque necesitan retroalimentación de los peligros potenciales de los productos químicos. Este método se puede aplicar a Daphnia magna con más enfoque en la toxicidad acuática. También Drosphila melanogaster para explorar más influencia en el género.
Se quedaría atascado con la idea de que estudiar los efectos a lo largo de las generaciones consume tiempo y consume energía. No te asustes por primera impresión. Seguir el protocolo le dará un resultado fructífero.
Para cultivar E.coli, pipetear 200 microlitros de las suspensiones bacterianas en 50 mililitros de medio LB en un matraz. O utilice un bucle de inoculación para elegir una pequeña colonia de agares NGM y colocarla en el medio LB. Para cultivar C.elegans, bajo un microscopio, contar los nematodos en los agares NGM de apilamiento preparados anteriormente.
Cuando el número alcance cerca de 2.000, utilice una punta estéril para cortar 1/6 del agar NGM y transferirlo a agares NGM recién preparados con césped bacteriano. Mantenga los agars NGM boca abajo en una incubadora de 22 grados Celsius para el cultivo posterior. Después de unas 36 horas, los nematodos se vuelven gravoides.
Utilice dos mililitros de agua estéril para eliminar los nematodos gravídicos y los huevos recién producidos en cada agar NGM en tubos de centrífuga estériles. Coloque los tubos en un estante durante 30 minutos para asentar los nematodos, y luego desechar el 85% de los sobrenadantes por pipeteo. Es muy importante juzgar si los nematodos son lo suficientemente gravid como para la sincronización.
De lo contrario, la operación de sincronización de edad sería en vano. Mezclar los pellets con siete volúmenes de solución de hipoclorito de sodio y agitar los tubos de centrífuga cada dos minutos durante cinco a ocho veces para anlicer las larvas y los nematodos adultos. Centrifugar los tubos a 700 veces G durante tres minutos a 20 grados Centígrados y luego desechar los sobrenadantes por pipeteo.
Re-suspenda los pellets en cinco volúmenes de agua estéril para lavar los huevos sincronizados por la edad. Centrifugar a 700 veces G durante tres minutos a 20 grados centígrados. Repita el lavado con agua estéril, dos veces.
A continuación, agregue un volumen de agua estéril en los tubos para suspender los huevos sincronizados por la edad. Distribuya las suspensiones de huevo pipeteando cincuenta micro litros en cada nuevo agar NGM con césped bacteriano. Mantenga los agares NGM en la parte superior en una incubadora de 20 grados Celsius durante 30 minutos, permitiendo que el agua se evapore o sea absorbida por el césped bacteriano.
Luego, entregue los agares NGM, boca abajo, para la cultura subsiguiente, y marque el tiempo como la hora del huevo. 36 horas después de la hora del huevo, los nematodos alcanzan la etapa de larvas L3. Utilice dos mililitros de agua estéril para eliminar los nematodos de cada agar NGM en tubos centrífugos.
Después de establecerse durante 30 minutos, reemplace el 85% de los sobrenadantes con K Medium para digerir los alimentos en las tripas durante dos horas. Luego, desecha los sobrenadantes. Utilice K Medium para ajustar las suspensiones de nematodos a unos 200 nematodos por cada 100 microlitros para experimentos posteriores.
Para evitar efectos de borde, en el área media de una microplaca estéril de 96 pocódicas, agregue 100 microlitros de control preparado o soluciones químicas en 10 pozos, como réplicas en seis grupos. Añadir 100 microlitros del nematodo preparado K Medium a cada uno de los 60 pozos. Marca la hora como T0. Realice la exposición durante 24 a 96 horas.
Después de la exposición, utilice una pipeta para recoger nematodos de cinco pozos en cada grupo, en seis tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. Asentar los nematodos durante 30 minutos y luego pipetear para desechar los sobrenadantes. Lave los nematodos en la parte inferior con un mililitro de agua esterilizada.
Asenta los nematodos durante 30 minutos. Deseche los sobrenadantes y utilice los nematodos en la parte inferior para las mediciones del indicador de la generación padre expuesta, marcada como F0. Recoger los nematodos de los cinco pozos restantes en cada grupo. Asentar y lavar los nematodos como antes.
A continuación, agregue 100 microlitros de agua estéril para volver a suspender los nematodos en cada tubo, y transfiera las suspensiones de nematodos uniformemente a tres agares NGM recién preparados con césped bacteriano. Incubar los nematodos durante 36 horas para convertirse en gravid, y realizar la sincronización de la edad, como anteriormente. Después de incubar los huevos sincronizados en agars NGM con césped bacteriano durante 36 horas, enjuague los nematodos en seis tubos de centrífuga.
Después de asentarse y lavar con un mililitro de agua esterilizada, utilice los nematodos en la parte inferior para las mediciones indicadoras de la generación de cría marcada como T1. Mezclar 99 mililitros de los agares calientes NGM con un mililitro de control o soluciones químicas. Después de preparar los agars con suspensiones bacterianas según el manuscrito, en el gabinete de biosequisa, deje a un lado los párpados superiores de los platos petri y exponga el césped bacteriano a la luz UV durante 15 minutos. Pipetear los huevos sincronizados por la edad en los agares tratados con UV.
Marque el inicio de la exposición a la generación primaria, F0, como día cero. Incubar los agares durante tres días a 20 grados centígrados. A continuación, utilice los nematodos maduros para medir los efectos en F0. Además, el tercer día, utilice una varilla de vidrio equipada con un alambre de fibra artificial doblado en un anillo para recoger nematodos maduros F0, y deslíceme sobre la superficie de los nuevos agares NGM tratados con UV.
En el cuarto día, escoge y descarta los nematodos F0 maduros de los agares NGM. En el sexto día, utilice los nematodos maduros F1 que han experimentado exposición durante tres días para la medición de índices. En este protocolo, los efectos transgeneracionales del cadmio, cobre, plomo y zinc en la frecuencia de flexión del cuerpo mostraron que las inhibiciones en el padre del nematodo, F0, después de la exposición prenatal eran menores que en su progenie, T1. Los efectos residuales multigeneracionales del sulfametoxazol en la vida útil y reproducción del nematodo mostraron que la reproducción se vio significativamente afectada en la exposición a la línea germinal, y que las toxicidades persistieron en generaciones no expuestas de las generaciones T3 a T6.
La exposición multigeneracional y los efectos residuales multigeneracionales del lindano en los índices bioquímicos y genéticos de nematodos mostraron efectos obesogénicos con alteraciones en la regulación de la señal de insulina. Además, los cambios entre la señalización sgk-1 y akt-1 indicaron que los nematodos de diferentes generaciones de exposición mostraron diferentes estrategias de respuesta para la tolerancia y la evitación. Compruebe el estado vivo de los nematodos antes de cada operación y modifique los pasos siguientes en consecuencia.
Otros efectos, por ejemplo, los efectos obesogénicos de los productos químicos, pueden incluirse para responder aún más a la creciente prevalencia de la obesidad a lo largo de generaciones. Según el método, se pueden explorar otros mecanismos. Por ejemplo, las señales epigenéticas hereditarias entre generaciones.
Las soluciones de cloro tienen fuertes potenciales oxidatativos, y evitar el contacto directo de la piel con ella.
