제시된 프로토콜은 환경에서 오랫동안 존재할 수 있는 단백질의 트랜스 및 다세대 효과에 대한 연구를 용이하게 할 것입니다. 우리는 99.5를 가진 자유로운 살아있는 선충을 hermaphrodites로 고용하여 트랜스 및 다세대 효과를 연구하는 데 시간과 노력을 절약했습니다. 이 기술은 현재 프로토콜에 있는 선충이 인간과 많은 보수적인 기계장치 또는 통로를 공유하기 때문에 최종 약의 장기 충격을 보여주기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 방법은 화학 물질의 잠재적 인 위험에 대한 피드백이 필요하기 때문에 제약 합성 및 환경 관리 분야에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 방법은 수생 독성에 더 중점을 둔 다프니아 마그나에 적용될 수 있다. 또한 Drosphila 멜라노가스터는 성별에 미치는 영향을 더 탐구합니다.
그 또는 그녀는 세대에 걸쳐 효과를 공부하는 것은 시간과 에너지 소비라는 생각에 갇혀있을 것입니다. 첫 인상에 두려워하지 마십시오. 프로토콜을 따라 유익한 결과를 얻을 수 있습니다.
배양 E.coli, 파이펫 200 마이크로 리터세균 현탁액에서 50 플라스크에서 LB 배지의 밀리리터로 세균 현탁액에서 마이크로리터. 또는 NGM 한조에서 작은 식민지를 선택하고 LB 배지에 배치하는 접종 루프를 사용합니다. C.elegans 를 문화하기 위해 현미경으로 이전에 준비된 누적 NGM agars의 선충을 계산합니다.
숫자가 2, 000에 가까워지면 멸균 팁을 사용하여 NGM 한천의 1/6을 잘라 내어 박테리아 잔디가있는 새로 준비 된 NGM 한고에 옮겨 넣습니다. NGM 한고를 22도의 섭씨 인큐베이터로 거꾸로 유지하여 후속 문화를 배양합니다. 약 36시간 후에 선충은 중력이 됩니다.
멸균 물 2밀리리터를 사용하여 각 NGM 한조에 중력 선충과 새로 생산된 알을 멸균 원심분리튜브로 씻어냅니다. 선충을 정착시키기 위해 30 분 동안 랙에 튜브를 놓고 파이펫팅으로 수퍼 나티츠의 85 %를 폐기하십시오. 선충이 동기화를 위해 충분히 중력인지 판단하는 것이 매우 중요합니다.
그렇지 않으면 연령 동기화 작업은 헛된 것입니다. 펠릿을 7권의 저혈당 나트륨 용액과 혼합하고 2분마다 원심분리기 튜브를 흔들어 애벌레와 성선선으로 5~8회 흔들어 줍니다. 20°C에서 3분간 700회 G로 튜브를 원심분리한 다음 파이펫팅으로 수퍼네이트를 폐기합니다.
노화 동기화 된 계란을 세척하기 위해 5 권의 멸균 물에 펠릿을 다시 중단합니다. 섭씨 20도에서 3분간 700배 G의 원심분리기. 멸균물로 세척을 두 번 반복합니다.
다음으로, 튜브에 멸균 수의 한 양을 추가하여 노화 동기화 된 계란을 다시 중단합니다. 세균 잔디와 각 새로운 NGM agars에 50 마이크로 리터를 파이프하여 계란 현탁액을 배포합니다. NGM 한고는 섭씨 20도 인큐베이터에서 30분간 위로 올려물이 증발하거나 세균잔디에 흡수될 수 있도록 합니다.
그런 다음 NGM 한고를 거꾸로 뒤집어 후속 문화를 위해 달걀 시간으로 시간을 표시합니다. 계란 시간 36 시간 후, 선충은 L3 애벌레 단계에 도달합니다. 멸균 수의 2 밀리리터를 사용하여 각 NGM 한충청을 원심분리기 튜브로 씻어냅니다.
30분 동안 정착한 후, 수퍼네이트의 85%를 K Medium으로 교체하여 2시간 동안 용기에 음식을 소화합니다. 그런 다음 초월체를 폐기합니다. K 배지를 사용하여 선충 현탁액을 후속 실험을 위해 100 마이크로리터 당 약 200개의 선충으로 조정합니다.
에지 효과를 피하기 위해 96웰의 멸균 마이크로 플레이트의 중간 영역에서 6개의 그룹에서 복제되는 것처럼 준비된 제어 또는 화학 용액 100마이크로리터를 10개의 우물에 추가합니다. 60개의 우물 각각에 준비된 선충 K 배지의 100마이크로리터를 추가합니다. 시간을 T0으로 표시합니다. 24~96시간 동안 노출을 수행합니다.
노출 후 파이펫을 사용하여 각 그룹의 5개의 우물에서 선충을 6개의 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 채취합니다. 선충을 30분 간 정산한 다음 파이펫을 사용하여 초월제를 폐기합니다. 멸균된 물 1밀리리터로 바닥에 선충을 씻으시다.
선충을 30분 간 정착시키면 됩니다. 수퍼나티를 버리고 F0으로 표시된 노출된 상위 세대의 표시기 측정을 위해 하단의 선충을 사용합니다. 각 그룹의 나머지 5개의 우물에서 선충을 수집합니다. 선충을 정착시키고 씻으시면 이전과 같이 씻으신다.
다음으로, 멸균수 100마이크로리터를 첨가하여 각 튜브의 선충을 다시 중단하고, 선충 현탁액을 세균 잔디가 있는 3개의 새로 준비된 NGM 아가에 고르게 옮기습니다. 선충을 36시간 동안 배양하여 중력이 되고, 이전과 같이 연령 동기화를 수행한다. NGM 한천에 36시간 동안 싱크로나이즈드 알을 배양한 후 선충을 6개의 원심분리기 튜브로 씻어냅니다.
살균된 물의 1밀리리터로 침전 및 세척한 후, T1로 표시된 자손 생성의 지표 측정을 위해 하단의 선충을 사용하십시오. 따뜻한 NGM 향료 99밀리리터를 1밀리리터의 제어 또는 화학 용액과 혼합합니다. 원고에 따라 박테리아 서스펜션으로 한고를 준비한 후, 바이오 안전 캐비닛에 페트리 접시의 상부 뚜껑을 따로 놓고 세균잔디를 UV 광에 15분 동안 노출시한다. 노화와 동기화된 계란을 UV 처리 된 한고에 파이펫.
부모 세대F0에 대한 노출의 시작을 제로일로 표시합니다. 섭씨 20도에서 3일간 한도를 배양합니다. 그런 다음 성숙한 선충을 사용하여 F0의 효과를 측정합니다. 또한, 셋째 날에는 인공 섬유 와이어가 장착된 유리 막대를 링에 구부러져 F0 성숙한 선충을 골라 새로운 UV 처리 NGM 아가의 표면으로 밀어 넣습니다.
4일째에는 NGM 한도에서 성숙한 F0 선충을 골라 버리세요. 6일째에는 지수 측정을 위해 3일 동안 노출을 경험한 F1 성숙한 선충을 사용하십시오. 이 프로토콜에서, 신체 굽힘 주파수에 카드뮴, 구리, 납 및 아연의 트랜스 세대 효과는 선충 부모F0의 억제가 태아, T1보다 적다는 것을 보여주었다. 선충 수명과 생식에 설페모트옥사졸의 다세대 잔류 효과는 생식선 노출에 현저히 영향을 받았으며, 독성은 T3에서 T6 세대까지 비노출된 세대에서 지속되었다는 것을 보여주었습니다.
선충생화학 및 유전지수에 대한 린다의 다세대 노출 및 다세대 잔류 효과는 인슐린 신호 조절에 장애가 있는 obesogenic 효과를 보였다. 더욱이, sgk-1과 akt-1 신호 사이의 변화는 다른 노출 세대에서 선충이 허용 오차와 회피에 대한 다른 응답 전략을 보여 주었다. 각 작업 전에 선충의 생활 상태를 확인하고 그에 따라 다음 단계를 수정합니다.
다른 효과, 예를 들어, 화학 물질의 obesogenic 효과, 더 세대에 걸쳐 비만의 증가 보급에 응답 하기 위해 포함 될 수 있습니다. 이 방법에 따라 추가 메커니즘을 탐색할 수 있습니다. 예를 들면, 세대 사이 유전 유전 신호.
염소 솔루션은 강한 산화 잠재력을 가지고 있으며 피부에 직접 접촉하지 않습니다.
