Das vorgestellte Protokoll wird Studien über die Trans- und die Mehrgenerationenwirkung von Proteinen erleichtern, die für eine lange Zeit in der Umwelt existieren können. Wir setzten eine freilebende Nematode mit 99,5 als Hermaphrodite ein, um Zeit und Mühe bei der Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten zu sparen. Diese Technik kann verwendet werden, um die langfristigen Auswirkungen von Endmedikamenten zu demonstrieren, da das Nematode im vorliegenden Protokoll viele konservative Mechanismen oder Wege mit menschenweisenteilt.
Diese Methode kann Einblicke in die Bereiche der pharmazeutischen Synthese und des Umweltmanagements geben, da sie eine Rückkopplung potenzieller Gefahren von Chemikalien benötigen. Diese Methode kann auf Daphnia magna mit mehr Fokus auf aquatische Toxizität angewendet werden. Auch Drosphila melanogaster, um den Einfluss auf das Geschlecht weiter zu erforschen.
Er oder sie würde mit der Idee stecken bleiben, dass das Studium von Effekten über Generationen hinweg zeit- und energieaufwendig ist. Lassen Sie sich auf den ersten Blick nicht erschrecken. Das Folgen des Protokolls wird Ihnen ein fruchtbares Ergebnis bringen.
Um E.coli zu kulturieren, Pipette 200 Mikroliter aus den bakteriellen Suspensionen in 50 Milliliter LB Medium in einem Kolben. Oder verwenden Sie eine Impfschleife, um eine kleine Kolonie aus NGM-Agars zu pflücken und sie in das LB-Medium zu legen. Um C.elegans zu kulturieren, zählen Sie unter dem Mikroskop die Nematoden auf den stapelnden NGM-Agars, die zuvor zubereitet wurden.
Wenn die Zahl nahe 2.000 erreicht, verwenden Sie eine sterile Spitze, um 1/6 des NGM-Agars zu schneiden und auf neu zubereitete NGM-Agars mit bakteriellem Rasen zu übertragen. Halten Sie die NGM-Agars in einem 22 Grad Celsius Inkubator für die nachfolgende Kultur auf dem Kopf. Nach etwa 36 Stunden werden die Nematoden gravid.
Verwenden Sie zwei Milliliter steriles Wasser, um die gravid Nematoden und neu produzierten Eier auf jedem NGM-Agar in sterile Zentrifugenröhrchen abzuspülen. Legen Sie die Rohre für 30 Minuten auf ein Gestell, um die Nematoden abzusetzen, und entsorgen Sie dann 85 % der Überräube durch Pipetten. Es ist sehr wichtig zu beurteilen, ob die Nematoden für die Synchronisation gravid genug sind.
Andernfalls wäre die Alterssynchronisation senkfrei. Mischen Sie die Pellets mit sieben Volumina Natriumhypochloritlösung und schütteln Sie die Zentrifugenröhrchen alle zwei Minuten fünf bis acht Mal, um die Larven und erwachsenen Nematoden zu lysieren. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 700 mal G für drei Minuten bei 20 Grad Celsius und entsorgen Sie dann die Überräube durch Pipetten.
Die Pellets in fünf Mengen sterilem Wasser wieder aufhängen, um die alterssynchronen Eier zu waschen. Zentrifuge bei 700 mal G für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Wiederholen Sie die Wäsche mit sterilem Wasser, zweimal.
Als nächstes fügen Sie ein Volumen sterilen Wassers in die Schläuche ein, um die alterssynchronisierten Eier wieder aufzuhängen. Verteilen Sie die Eisuspensionen, indem Sie fünfzig Mikroliter auf jeden neuen NGM-Agar mit bakteriellem Rasen pfeifen. Halten Sie die NGM-Agars 30 Minuten lang in einem 20 Grad Celsius Inkubator auf der Oberseite, so dass das Wasser verdunstet oder vom bakteriellen Rasen absorbiert wird.
Dann drehen Sie die NGM-Agars auf den Kopf, für die nachfolgende Kultur, und markieren Sie die Zeit als die Eizeit. 36 Stunden nach der Eizeit erreichen die Nematoden das L3-Larvenstadium. Verwenden Sie zwei Milliliter steriles Wasser, um die Nematoden von jedem NGM-Agar in Zentrifugenrohre zu spülen.
Nach 30 Minuten Setzung 85% der Überräube durch K Medium ersetzen, um die Nahrung im Darm für zwei Stunden zu verdauen. Entsorgen Sie dann die Überräube. Verwenden Sie K Medium, um die Nematodensuspensionen für nachfolgende Experimente auf etwa 200 Nematoden pro 100 Mikroliter einzustellen.
Um Kanteneffekte zu vermeiden, fügen Sie im mittleren Bereich einer 96-well sterilen Mikroplatte 100 Mikroliter vorbereiteter Kontroll- oder chemischer Lösungen in 10 Brunnen ein, wie sie in sechs Gruppen nachbilden. Fügen Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Nematode K Medium zu jedem der 60 Brunnen hinzu. Markieren Sie die Zeit als T0. Führen Sie die Belichtung für 24 bis 96 Stunden durch.
Nach der Exposition verwenden Sie eine Pipette, um Nematoden aus fünf Brunnen in jeder Gruppe in sechs 1,5 Milliliter Zentrifugenröhren zu sammeln. Die Nematoden für 30 Minuten begleichen und dann Pipette, um die Überräube zu entsorgen. Waschen Sie die Nematoden am Boden mit einem Milliliter sterilisiertem Wasser.
Die Nematoden 30 Minuten lang begleichen. Entsorgen Sie die Überräube, und verwenden Sie die Nematoden unten für Indikatormessungen der exponierten übergeordneten Generation, die als F0 markiert ist. Sammeln Sie die Nematoden aus den verbleibenden fünf Brunnen in jeder Gruppe. Die Nematoden wie bisher absetzen und waschen.
Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter steriles Wasser hinzu, um die Nematoden in jedem Rohr wieder aufzuhängen, und übertragen Sie die Nematodensuspensionen gleichmäßig auf drei neu zubereitete NGM-Agars mit bakteriellem Rasen. Inkubieren Sie die Nematoden für 36 Stunden, um gravid zu werden, und führen Sie alterssynchrone, wie zuvor. Nachdem Sie die synchronisierten Eier 36 Stunden lang auf NGM-Agars mit bakteriellem Rasen brüten, spülen Sie die Nematoden in sechs Zentrifugenröhren.
Nachdem Sie sich mit einem Milliliter sterilisiertem Wasser absetzen und waschen, verwenden Sie die Nematoden unten für Indikatormessungen der als T1 markierten Nachkommengeneration. Mischen Sie 99 Milliliter der warmen NGM Agars mit einem Milliliter Kontroll- oder chemischer Lösungen. Nach der Zubereitung der Agars mit Bakteriensuspensionen nach dem Manuskript, im Bio-Sicherheitsschrank, legen Sie die oberen Deckel der Petrischalen beiseite und setzen Sie den bakteriellen Rasen für 15 Minuten UV-Licht aus. Pipette die alterssynchronisierten Eier auf die UV-behandelten Agars.
Markieren Sie den Beginn der Exposition gegenüber der übergeordneten Generation, F0, als Tag Null. Die Agars drei Tage lang bei 20 Grad Celsius bebrüten. Verwenden Sie dann die ausgereiften Nematoden, um Effekte in F0 zu messen. Verwenden Sie auch am dritten Tag eine Glasstange, die mit einem künstlichen Faserdraht ausgestattet ist, der in einen Ring gebogen ist, um F0-Reifennematoden zu pflücken und auf die Oberfläche neuer UV-behandelter NGM-Agars zu gleiten.
Holen Sie sich am vierten Tag die reifen F0-Nematoden von NGM-Agars heraus und entsorgen Sie sie. Verwenden Sie am sechsten Tag die reifen F1-Nematoden, die drei Tage lang ausgesetzt waren, für die Indexmessung. In diesem Protokoll zeigten die transgenerationalen Wirkungen von Cadmium, Kupfer, Blei und Zink auf die Körperbiegefrequenz, dass die Hemmungen im Nematodenelternteil F0 nach pränataler Exposition geringer waren als bei ihrer Nachkommenschaft T1. Die mehrgenerationenlichen Restwirkungen von Sulfamethoxazol auf die Nematodenlebensdauer und Fortpflanzung zeigten, dass die Fortpflanzung bei der Exposition gegenüber Keimlinien signifikant beeinflusst wurde und die Toxizitäten in nicht exponierten Generationen von T3 bis T6-Generationen fortbestehen.
Die mehrgenerationenliche Exposition und die mehrgenerationenübergreifenden Restwirkungen von Lindan auf die biochemischen und genetischen Nematodenindizes zeigten obessogene Wirkungen mit Störungen in der Insulinsignalregulation. Darüber hinaus zeigten die Veränderungen zwischen sgk-1 und akt-1 Signalisierung, dass Nematoden aus verschiedenen Expositionsgenerationen unterschiedliche Reaktionsstrategien für Toleranz und Vermeidung aufwiesen. Überprüfen Sie den Lebendensstatus der Nematoden vor jedem Vorgang, und ändern Sie die folgenden Schritte entsprechend.
Andere Effekte, z. B. obessogene Wirkungen von Chemikalien, können einbezogen werden, um die zunehmende Prävalenz von Adipositas über Generationen weiter zu beantworten. Basierend auf der Methode können weitere Mechanismen erforscht werden. Zum Beispiel die vererbbaren epigenetischen Signale zwischen den Generationen.
Die Chlorlösungen haben starke oxidative Potenziale und vermeiden den direkten Kontakt der Haut mit ihr.
