Le protocole présenté facilitera les études sur les effets trans et multigénérationnels des protéines qui peuvent exister longtemps dans l’environnement. Nous avons employé un nématode vivant librement avec 99.5 comme hermaphrodites pour gagner le temps et l’effort en étudiant des effets trans et multigénérationnels. Cette technique peut être utilisée pour démontrer les impacts à long terme des médicaments finaux parce que le nématode dans le présent protocole partage de nombreux mécanismes ou voies conservatrices avec les humains.
Cette méthode peut donner un aperçu des domaines de la synthèse pharmaceutique et de la gestion de l’environnement parce qu’ils ont besoin de rétroaction sur les dangers potentiels des produits chimiques. Cette méthode peut être appliquée à Daphnia magna en se concentrant davantage sur la toxicité aquatique. Aussi Drosphila melanogaster pour explorer davantage l’influence sur le sexe.
Il serait coincé avec l’idée que l’étude des effets sur les générations est le temps et l’énergie. N’adez pas peur à la première impression. Suivre le protocole vous permettra d’obtenir des résultats fructueux.
Pour la culture d’E.coli, pipette 200 microlitres des suspensions bactériennes en 50 millilitres de milieu LB dans un flacon. Ou utilisez une boucle d’inoculation pour choisir une petite colonie d’agars NGM et la placer dans le milieu LB. Pour la culture C.elegans, sous un microscope, comptez les nématodes sur l’empilement des géloses NGM préparées plus tôt.
Lorsque le nombre atteint près de 2000, utilisez une pointe stérile pour couper 1/6 de l’agar NGM et le transférer sur des agars NGM nouvellement préparés avec pelouse bactérienne. Gardez les agars NGM à l’envers dans un incubateur de 22 degrés Celsius pour la culture suivante. Après environ 36 heures, les nématodes deviennent gravid.
Utilisez deux millilitres d’eau stérile pour éliminer les nématodes gravid et les œufs nouvellement produits sur chaque gélose NGM dans des tubes de centrifugeuse stériles. Placer les tubes sur une grille pendant 30 minutes pour régler les nématodes, puis jeter 85% des supernatants par pipetting. Il est très important de juger si les nématodes sont suffisamment gravid pour la synchronisation.
Sinon, l’opération de synchronisation de l’âge serait vaine. Mélanger les granulés avec sept volumes de solution hypochlorite de sodium et secouer les tubes de centrifugeuse toutes les deux minutes pendant cinq à huit fois pour lyser les larves et les nématodes adultes. Centrifuger les tubes à 700 fois G pendant trois minutes à 20 degrés Celsius, puis jeter les supernatants par pipetting.
Suspendre à nouveau les granulés dans cinq volumes d’eau stérile pour laver les œufs synchronisés par âge. Centrifugeuse à 700 fois G pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Répétez le lavage à l’eau stérile, deux fois.
Ensuite, ajoutez un volume d’eau stérile dans les tubes pour suspendre à nouveau les œufs synchronisés par âge. Répartir les suspensions d’oeufs en pipetant cinquante micro litres sur chaque nouvelle agars NGM avec pelouse bactérienne. Gardez les agars NGM en haut dans un incubateur de 20 degrés Celsius pendant 30 minutes, ce qui permet à l’eau de s’évaporer ou d’être absorbée par la pelouse bactérienne.
Ensuite, retournez les agars NGM, à l’envers, pour la culture suivante, et marquez le temps comme le temps des oeufs. 36 heures après l’heure de l’œuf, les nématodes atteignent le stade des larves de L3. Utilisez deux millilitres d’eau stérile pour rincer les nématodes de chaque gélose NGM dans des tubes de centrifugeuse.
Après avoir réglé pendant 30 minutes, remplacer 85% des supernatants par K Medium pour digérer la nourriture dans les tripes pendant deux heures. Ensuite, jetez les surnatants. Utilisez K Medium pour ajuster les suspensions nématodes à environ 200 nématodes par 100 microlitres pour des expériences ultérieures.
Pour éviter les effets de bord, dans la zone centrale d’une microplaque stérile de 96 puits, ajoutez 100 microlitres de solutions de contrôle préparées ou chimiques dans 10 puits, comme le reproduit six groupes. Ajouter 100 microlitres du nématode K Medium préparé à chacun des 60 puits. Marquez l’heure en tant que T0. Effectuez l’exposition pendant 24 à 96 heures.
Après l’exposition, utilisez une pipette pour recueillir les nématodes de cinq puits de chaque groupe, en six tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Régler les nématodes pendant 30 minutes, puis pipette pour jeter les supernatants. Laver les nématodes au fond avec un millilitre d’eau stérilisée.
Régler les nématodes pendant 30 minutes. Jetez les supernatants et utilisez les nématodes en bas pour les mesures indicielles de la génération parent exposée, marquées F0. Recueillir les nématodes des cinq autres puits de chaque groupe. Régler et laver les nématodes comme précédemment.
Ensuite, ajouter 100 microlitres d’eau stérile pour suspendre à nouveau les nématodes dans chaque tube, et transférer les suspensions nématode uniformément sur trois agars NGM nouvellement préparés avec pelouse bactérienne. Incuber les nématodes pendant 36 heures pour devenir gravid, et effectuer la synchronisation de l’âge, comme précédemment. Après avoir incubé les œufs synchronisés sur les géloses NGM avec la pelouse bactérienne pendant 36 heures, rincer les nématodes dans six tubes de centrifugeuse.
Après s’être installés et lavés avec un millilitre d’eau stérilisée, utilisez les nématodes en bas pour des mesures indicielles de la génération de descendants marquées T1. Mélanger 99 millilitres des agars chauds NGM avec un millilitre de contrôle ou des solutions chimiques. Après avoir préparé les agars avec des suspensions bactériennes selon le manuscrit, dans l’armoire de bio-sécurité, mettre de côté les couvercles supérieurs des boîtes de Pétri et exposer la pelouse bactérienne à la lumière UV pendant 15 minutes. Pipette les oeufs synchronisés par âge sur les agars traités aux UV.
Marquez le début de l’exposition à la génération parente, F0, comme jour zéro. Incuber les agars pendant trois jours à 20 degrés Celsius. Ensuite, utilisez les nématodes matures pour mesurer les effets en F0. En outre, le troisième jour, utilisez une tige de verre équipée d’un fil de fibre artificiel plié dans un anneau pour choisir les nématodes matures F0, et glissez sur la surface de nouvelles agars NGM traitées aux UV.
Le quatrième jour, choisissez et jetez les nématodes F0 matures des agars NGM. Le sixième jour, utilisez les nématodes matures F1 qui ont connu une exposition pendant trois jours pour la mesure des indices. Dans ce protocole, les effets transgénérationnels du cadmium, du cuivre, du plomb et du zinc sur la fréquence de flexion du corps ont montré que les inhibitions chez le parent nématode, F0, après exposition prénatale étaient inférieures à celles de leur progéniture, T1. Les effets résiduels multigénérationnels du sulfamethoxazole sur la durée de vie et la reproduction des nématodes ont montré que la reproduction était significativement affectée par l’exposition aux lignées germinales, et que les toxicités persistaient dans les générations non exposées des générations T3 à T6.
L’exposition multigénérationnelle et les effets résiduels multigénérationnels du lindane sur les indices biochimiques et génétiques des nématodes ont montré des effets obésogènes avec des perturbations dans la régulation du signal d’insuline. En outre, les changements entre la signalisation sgk-1 et akt-1 ont indiqué que les nématodes de différentes générations d’exposition présentaient différentes stratégies de réponse pour la tolérance et l’évitement. Vérifiez l’état de vie des nématodes avant chaque opération et modifiez les étapes suivantes en conséquence.
D’autres effets, par exemple, les effets obésogènes des produits chimiques, peuvent être inclus pour répondre davantage à la prévalence croissante de l’obésité au fil des générations. Sur la base de la méthode, d’autres mécanismes peuvent être explorés. Par exemple, les signaux épigénétiques héréditaires entre les générations.
Les solutions de chlore ont de forts potentiels oxydatifs, et évitent le contact direct de la peau avec elle.
