O protocolo apresentado facilitará estudos sobre os efeitos trans e multigeracionais de proteínas que podem existir por muito tempo no meio ambiente. Empregamos um nematoide de vida livre com 99,5 como hermafroditas para economizar tempo e esforço no estudo de efeitos trans e multigeracionais. Essa técnica pode ser usada para demonstrar os impactos a longo prazo das drogas finais porque o nematoide no presente protocolo compartilha muitos mecanismos ou caminhos conservadores com os seres humanos.
Este método pode fornecer insights sobre os campos da síntese farmacêutica e do manejo ambiental, pois eles precisam de feedback dos potenciais perigos dos produtos químicos. Este método pode ser aplicado à Daphnia magna com mais foco na toxicidade aquática. Também Drosphila melanogaster para explorar ainda mais a influência sobre o gênero.
Ele ou ela ficaria preso à ideia de que estudar efeitos ao longo de gerações é o tempo e o consumo de energia. Não se assuste com a primeira impressão. Seguir o protocolo lhe dará um resultado frutífero.
Para a cultura E.coli, pipetas 200 microliters das suspensões bacterianas em 50 mililitros de meio LB em um frasco. Ou use um laço inoculante para escolher uma pequena colônia de ágars NGM e colocá-lo no meio LB. Para cultivar C.elegans, sob um microscópio, conte os nematoides nos ágares ngm empilhados preparados anteriormente.
Quando o número chegar perto de 2.000, use uma ponta estéril para cortar 1/6 do ágar NGM e transferi-lo para ágars NGM recém-preparados com gramado bacteriano. Mantenha os ágars NGM de cabeça para baixo em uma incubadora Celsius de 22 graus para a cultura subsequente. Depois de cerca de 36 horas, os nematoides ficam gravid.
Use dois mililitros de água estéril para eliminar os nematoides gravid e ovos recém-produzidos em cada ágar NGM em tubos de centrífuga estéreis. Coloque os tubos em um rack por 30 minutos para acalmar os nematoides e, em seguida, descarte 85% dos supernantes por pipetação. É muito importante julgar se os nematoides são gravid o suficiente para sincronização.
Caso contrário, a operação de sincronização etária seria em vão. Misture as pelotas com sete volumes de solução de hipoclorito de sódio e agite os tubos centrífugas a cada dois minutos por cinco a oito vezes para lise as larvas e nematoides adultos. Centrifugar os tubos a 700 vezes G por três minutos a 20 graus Celsius e, em seguida, descartar os supernacantes por pipetação.
Suspenda as pelotas em cinco volumes de água estéril para lavar os ovos sincronizados por idade. Centrífuga a 700 vezes G por três minutos a 20 graus Celsius. Repita a lavagem por água estéril, duas vezes.
Em seguida, adicione um volume de água estéril nos tubos para suspender re suspendida os ovos sincronizados por idade. Distribua as suspensões dos ovos pipetando 50 micro litros em cada novo ágar de NGM com gramado bacteriano. Mantenha os ágars ngm do lado superior em uma incubadora de 20 graus Celsius por 30 minutos, permitindo que a água evapore ou seja absorvida pelo gramado bacteriano.
Em seguida, vire os ágars ngm, de cabeça para baixo, para a cultura subsequente, e marque o tempo como o tempo do ovo. 36 horas após o tempo do ovo, os nematoides chegam ao estágio das larvas L3. Use dois mililitros de água estéril para tirar os nematoides de cada ágar NGM em tubos centrífugas.
Depois de se contentar por 30 minutos, substitua 85% dos supernacantes por K Medium para digerir o alimento nas entranhas por duas horas. Então, descarte os supernantes. Use o K Medium para ajustar as suspensões do nematoide a cerca de 200 nematoides por 100 microliters para experimentos subsequentes.
Para evitar efeitos de borda, na área média de uma microplacão estéril de 96 poços, adicione 100 microlitros de controle preparado ou soluções químicas em 10 poços, como replica em seis grupos. Adicione 100 microliters do nematode K Médio preparado a cada um dos 60 poços. Marque o tempo como T0. Realizar a exposição por 24 a 96 horas.
Após a exposição, use uma pipeta para coletar nematoides de cinco poços em cada grupo, em seis tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Resolva os nematoides por 30 minutos e depois pipeta para descartar os supernantes. Lave os nematoides na parte inferior com um mililitro de água esterilizada.
Resolva os nematoides por 30 minutos. Descarte os supernantes e use os nematoides na parte inferior para medir indicadores da geração pai exposta, marcado como F0. Recolhe os nematoides dos cinco poços restantes em cada grupo. Acomode e lave os nematoides como antes.
Em seguida, adicione 100 microliters de água estéril para suspender os nematoides em cada tubo, e transfira as suspensões de nematoides uniformemente para três ágaros NGM recém-preparados com gramado bacteriano. Incubar os nematoides por 36 horas para se tornar gravid, e realizar a sincronização etária, como anteriormente. Depois de incubar os ovos sincronizados em ágars NGM com gramado bacteriano por 36 horas, lave os nematoides em seis tubos de centrífuga.
Após a fixação e lavagem com um mililitro de água esterilizada, use os nematoides na parte inferior para medir indicadores da geração da prole marcada como T1. Misture 99 mililitros dos ágares ngm quentes com um mililitro de controle ou soluções químicas. Depois de preparar os ágars com suspensões de bactérias de acordo com o manuscrito, no armário de biosegurança, reserve as tampas superiores das placas de petri e exponha o gramado bacteriano à luz UV por 15 minutos. Pipeta os ovos sincronizados com idade nos ágares tratados com UV.
Marque o início da exposição à geração dos pais, F0, como o dia zero. Incubar os ágars por três dias a 20 graus Celsius. Em seguida, use os nematoides maduros para medir efeitos em F0. Além disso, no terceiro dia, use uma haste de vidro equipada com um fio de fibra feito pelo homem dobrado em um anel para escolher nematoides maduros F0, e deslize para a superfície de novos ágars NGM tratados com UV.
No quarto dia, escolha e descarte os nematoides F0 maduros dos ágars ngm. No sexto dia, use os nematoides maduros da F1 que experimentaram exposição por três dias para medição de índices. Neste protocolo, os efeitos transgeracionais de cádmio, cobre, chumbo e zinco na frequência de dobra corporal mostraram que as inibições no pai do nematodo, F0, após a exposição pré-natal foram menores do que em sua prole, T1. Os efeitos residuais multigeracionais do sulfametoxonazol na vida útil e reprodução do nematoides mostraram que a reprodução foi significativamente afetada na exposição da linha germinal, e as toxicidades persistiram em gerações não expostas das gerações T3 a T6.
A exposição multigeracional e os efeitos residuais multigeracionais de lindane nos índices bioquímicos e genéticos do nematodo mostraram efeitos obesogênicos com distúrbios na regulação do sinal de insulina. Além disso, as mudanças entre a sinalização sgk-1 e akt-1 indicaram que nematoides de diferentes gerações de exposição mostraram diferentes estratégias de resposta para tolerância e evasão. Verifique o estado de vida dos nematoides antes de cada operação e modifique as seguintes etapas em conformidade.
Outros efeitos, por exemplo, efeitos obesogênicos de produtos químicos, podem ser incluídos para responder ainda mais à crescente prevalência de obesidade ao longo das gerações. Com base no método, outros mecanismos podem ser explorados. Por exemplo, os sinais epigenéticos herdáveis entre gerações.
As soluções de cloro têm fortes potenciais oxidativos, e evitam o contato direto da pele com ele.
