Zebra balığı hücre hatlarını kullanan sitotoksisite testi protokolü, balıklardaki kimyasalların akut toksisitesi ile ilgili soruları cevaplayabilir veya diğer alternatif balık tahlilleri için uygun test konsantrasyonlarını tanımlamaya yardımcı olabilir. Bu 96 kuyucuklu plaka testinin temel avantajı, ekotoksisite çalışmalarında önemli bir balık türü olan zebra balığı hücreleri için sitotoksisiteyi belirlemek için farklı canlılık uç noktalarının birleştirilmesidir. Protokol çok basittir.
Açıklanan tüm adımları doğru bir şekilde izlerseniz, herhangi bir sorunla karşılaşmamanız gerekir. Bu protokol, embriyonik hücrelerdeki hepatositler gibi farklı organlardan veya yaşam evrelerinden türetilen balık hücre hatlarındaki etkileri değerlendiren hayvan bazlı ekotoksisite çalışmalarının elde edilmesine yardımcı olur. ZEM2S veya ZFL hücrelerini kaplamaya başlamak için, tahliller için istenen sayıda hücreyi elde etmek için gereken ilgili hücre süspansiyonlarının hacmini hesaplayın.
Steril bir reaktif rezervuarını, karşılık gelen hücre hattı için tam kültür ortamı ile doldurun ve hücre süspansiyonunun hesaplanan hacmini toplam 20 mililitre hacim için rezervuara aktarın. Çok kanallı pipet kullanarak, herhangi bir köpük veya kabarcık oluşturmadan çözeltiyi yavaşça yukarı ve aşağı karıştırın. Daha sonra çok kanallı mikropipeti kullanarak, ZEM2S hücreleri için kuyu başına 60.000 hücre ve ZFL hücreleri için kuyu başına 40.000 hücrelik canlı bir hücre sayısı elde etmek için şeffaf bir polistiren 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Plakayı 24 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Her iki hücre tipini de test kimyasallarının farklı konsantrasyonlarına maruz bırakmak için, fetal sığır serumu veya FBS olmadan ilgilenilen hücre hattı için kültür ortamında istenen konsantrasyonda test kimyasal çözeltileri hazırlayın. 24 saatlik inkübasyonu sonra, çok kanallı bir mikropipet kullanarak harcanan medyayı kuyulardan dikkatlice atın.
Daha sonra, teknik üçlülere kuyu başına 100 mikrolitre belirli bir test kimyasal çözeltisi ekleyin, bu da her test kimyasal konsantrasyonu için üç kuyucuk anlamına gelir. Kontrol gruplarını teknik üçlü katlardaki test kimyasallarıyla aynı plakaya yerleştirin. Boş kontrol için, üç hücresiz kuyucuğa 100 mikrolitre pozlama ortamı ekleyin.
Negatif kontrol için, maruz kalma ortamının 100 mikrolitresini hücreleri içeren üç kuyucuğa ekleyin. Pozitif kontrol için, hücreleri içeren üç kuyuyu, maruz kalma ortamında hazırlanan% 1'lik bir Triton X-100 çözeltisine maruz bırakın. Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için plakaları parafilm veya yapışkan sızdırmazlık folyosu ile kapatın ve plakaları 24 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.
Test kimyasal maruziyetinden 24 saat sonra, içeriği bir toplama tepsisine dökerek maruz kalma ortamını kuyucuklardan dikkatlice atın ve her bir kuyucuğu 200 mikrolitre PBS ile yıkayın. Daha sonra PBS'yi hücreleri kaybetmeden çıkarmak için, dikkatlice bir toplama tepsisine dökün. Alamar Blue veya AB ve CFDA-tahlillerini yapmak için, kuyu başına 100 mikrolitre ilgili çözeltiyi ekleyin ve plakayı karanlıkta 28 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, bir floresan plaka okuyucusundaki floresanı, metinde belirtilen uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında ölçün. Nötr kırmızı veya NR testini gerçekleştirmek için, mililitre başına 40 mikrogram konsantrasyona sahip NR çalışma çözeltisini alın ve 10 dakika boyunca 600 G'de santrifüj yapın. Ardından, içeriği bir toplama tepsisine dökerek daha önce eklenen AB ve CFDA-çözümlerini kuyulardan dikkatlice çıkarın.
Çok kanallı bir mikropipet kullanarak, kuyu başına 100 mikrolitre NR çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı üç saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka bittikten sonra, NR çözeltisini plakadan dikkatlice bir toplama tepsisine dökün ve kuyu başına 150 mikrolitre PBS ekleyerek kuyuları yıkayın. Yıkadıktan sonra, kuyu başına 150 mikrolitre NR ekstraksiyon çözeltisi ekleyin ve bir plaka okuyucu kullanarak emiciliği 540 nanometrede ölçmeden önce plakayı bir plaka çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
MTT testini gerçekleştirmek için, 24 saatlik test kimyasal maruziyetinden sonra, içeriği bir toplama tepsisine dökerek ve çok kanallı bir mikropipet kullanarak maruz kalma ortamını dikkatlice çıkarın, karanlıkta kuyucuk başına 100 mikrolitre MTT çalışma çözeltisi ekleyin. Plakayı karanlıkta dört saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, içeriği bir toplama tepsisine dökerek MTT çözeltisini atın ve formazan kristallerini çıkarmak için her bir oyuğa 100 mikrolitre DMSO ekleyin.
Bir plaka okuyucu kullanarak absorpsiyonu 517 nanometrede ölçmeden önce plakayı bir plaka çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. AP testi için, boş, pozitif kontrol ve test kimyasallarının yüksek sitotoksik konsantrasyonlarına karşılık gelen kuyucuklar, canlı hücrelerin yokluğunu veya azalmasını gösteren mavi renk ve düşük floresan göstermiştir. Buna karşılık, düşük sitotoksik test kimyasalı konsantrasyonlarına ve çok sayıda canlı hücre içeren negatif kontrole karşılık gelen kuyular, resazurini daha yüksek floresana sahip pembe resorufin'e dönüştürdü.
NR testi için, test kimyasallarının yüksek sitotoksik konsantrasyonları ve pozitif kontrol, düşük emilimli şeffaf veya soluk pembe iken, NR boyasını koruyan canlı hücreler içeren kuyucuklar koyu pembe renk ve yüksek emilim göstermiştir. Benzer şekilde, MTT testi için, canlı hücreleri olmayan kuyular şeffaftır, canlı hücreler içerenler MTT'yi menekşe renkli formazan'a dönüştürür. Hesaplanan hücre canlılık yüzdelerine dayanarak, ZFL ve ZEM2S hücre hatlarındaki farklı test kimyasalları için yarım maksimum inhibitör konsantrasyonu veya IC50 değeri tahmin edilmiştir.
FBS'li ve FBS'siz kültürler için hücre canlılığında anlamlı bir fark gözlenmemiştir, bu da FBS'den yoksun kültür medyasının 24 saatlik kimyasal maruz kalma süresi için uygunluğunu göstermektedir. MTT ve NR tahlilleri, DMSO konsantrasyonlarının% 0.1 ila% 1 arasında değişen hücre canlılığı üzerinde anlamlı bir etkisi olmadığını göstermiştir, bu da bu hücre hatlarının DMSO'nun% 1'e kadar çözücü olarak kullanımını desteklediğini göstermektedirTüm prosedür sırasında kendiliğinden ayrılmayı önlemek için kaplanmış hücreleri kullanırken özel dikkat gösterin ve herhangi bir boya çökelmesini önlemek için nötr kırmızı çalışma solüsyonunu dikkatlice hazırlayın. Bu prosedür, in vitro modeller kullanılarak balıklar üzerindeki kimyasal etkilerin çeşitli yönlerini ele alan çalışmalara uygulanabilir ve hayvan bazlı ekotoksisite çalışmalarının ilerlemesine katkıda bulunabilir.
