Bu protokol, stimülasyonun erken olayları sırasında endojen IRF5 aktivasyonunu değerlendirmek için ticari olarak elde edilebilen reaktifler ve araçlarla birlikte yaygın olarak kullanılan bir teknik kullanır. Kolayca diğer hücresel bağlamda IRF5 biyoloji sondalama için uygulanabilir. Yerel SAYFA yaygın olarak kullanılan bir teknik olsa da, net, sağlam, yorumlanabilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek teknik olarak zor olabilir.
Ticari çalışan bir arabellek ve jel sistemi kullanarak değişkenliği en aza indirmek için yardımcı olur. Detaylara dikkat etmek esastır ve deneyim, iyi sonuçlar elde etmede başarının anahtarıdır. Bu değiştirilmiş yerel SAYFA protokolü, başarının anahtarı olan ince ayrıntılarla birlikte birçok adım içerir.
Görsel gösteri araştırmacılar için yararlı olacağını bu ayrıntıları gösterebilir. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit, tam RPMI 1640 orta ile bir T75 şişesinde CAL-1 hücre kültürünü koruyun. Hücreleri uyarmaya hazır olduğunuzda, 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 200 x g'de beş dakika santrifüj edin.
Supernatant çıkarın ve homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için orta pelet yeniden askıya. Daha sonra hücreleri hemositometre ile hesaplayın ve her kuyuda dört mililitre önceden ısıtılmış ortama sahip altı kuyulu bir tabakta her 1,000, 000 hücrelik bir yoğunlukta tohumlayın. Hücreleri 20 ila 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve birleşimin ertesi gün %90 ila %95'e ulaşmasını bekleyin, her mililitre De'ye dört mikrolitre mikrolitre ekleyerek hücreleri uyarın, hücrelerle kontrol iyi bir şekilde bırakmayı ve R848 tedavisi yapmayı unutmayın.
R848'i eşit olarak dağıtmak için plakayı yavaşça bir taraftan diğer yana sallayın, ardından hücreleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 2 ila 16 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonlarını plakadan 5 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın. Hücreleri 200 x g'de beş dakika santrifüj edin, sonra süpernatantı çıkarın ve pbs'nin bir mililitresinde peleti yeniden askıya alın.
Hücre süspansiyonuna 1,5 mililitrelik bir tüp aktarın ve 12,000 x g'de 4 santigrat derecede 30 ila 60 saniye aşağı döndürün, sonra da supernatant'ı dikkatlice çıkarın. El yazması yol tarifine göre lysis tamponu hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar buzüzerinde tutun. 30 mikrolitre likit buz gibi lysis tamponu ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için hücre pelet yeniden askıya alın.
Sonra 15-20 dakika buz üzerinde tüp kuluçka. 4 santigrat derecede 15 ila 20 dakika 12, 000 x g'de santrifüj yaparak lysate'yi netleştirin ve süpernatantı önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ekstreleri her zaman buzda tutmayı unutmayın. Daha sonra, Bradford Reagent kullanarak protein konsantrasyonu ölçün.
El yazması yönlere göre üst ve alt hazneli elektroforez tamponlarını hazırlayın ve kuyuları bozmadan %3-12 yerli PAGE jelini suyla iyice durulayın, sodyum deoksikolat alırken ekstra özen alınmalıdır. Kimyasalın işlenmesi için laboratuvar önlüğü, emniyet gözlükleri ve maske gibi koruma için PPE gereklidir. Daha sonra, Mini Jel Tank içine jel ayarlayın, tarak çıkarın, hazırlanan üst ve alt oda elektroforez tamponlar ekleyin ve önceden 4 derece santigrat soğuk oda veya buz üzerinde 150 volt 30 dakika çalıştırın.
Bu arada, 4X Yerli Örnek Tampon ile buz üzerinde hücresel proteinler karıştırarak yükleme için örnekleri hazırlamak. Ön çalışma tamamlandıktan sonra, her kuyuya 10 ila 15 mikrogram protein yükleyin ve jeli 85 voltta 30 dakika çalıştırın ve ardından 150 voltta iki saat çalıştırın. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sds çalışan tampon jel ıslatın.
Yaklaşık beş dakika boyunca metanol içinde ıslatarak polivinilidendiol diflorür membran etkinleştirin. Yönünü belirtmek için membranın bir köşesinde bir kesim yapın ve transfer sandviçini üreticinin protokolüne göre monte edin. Transfer kasetini tanka yerleştirin ve 20 voltta bir saat buz üzerinde aktarın.
Daha sonra membranı plastik forsepslerle kasetten çıkarın ve oda sıcaklığında tamponu bloke ederek membranı 45 dakika boyunca sallanan bir çalkalayıcıda engelleyin. Daha sonra, membranı bir gecede 4 derece veya oda sıcaklığında iki saat boyunca birincil antikorla kuluçkaya yatırın ve sallarken 1XTBST yıkama tamponu ile üç dakika yıkayın. Daha sonra tekrar 45 dakika oda sıcaklığında 1XTBST yıkama tampon kullanarak ikincil antikor ile membran kuluçka, yıkar tekrar.
Sonra uygun bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak leke tazyik. Bu protokol kullanılarak R848 ile uyarılan veya uyarılamayan CAL-1 hücreleri immünoblot ile analiz edildi. Uyarılmamış CAL-1 hücrelerinde, IRF5 yerel SAYFADA monomerik formuna karşılık gelen tek bir bant olarak algılandı.
Uyarılmış hücreler için, IRF5 monomer düzeyi azalırken, dimer düzeyi arttı. IRF5'te çeşitli yapılarla transfece edilmiş 293 T hücresi üzerinde anti-IRF5 antikoriçeren bir immünoblot yapıldı. Anti-IRF5 antikorözgülüğünü gösteren transfected kontrol hiçbir IRF5 tespit edildi.
Monomerik IRF5'e karşılık gelen tek bir bant sadece 293 T hücrelerinde aşırı ifade veren IRF5'te tespit edildi. IRF5 aktive edici proteinleri kodlayan yapılar birlikte transfeced edildiğinde, IRF5'in dimerik formuna karşılık gelen yavaş hareket eden bir bant ortaya çıktı. Ancak RIG-I ile ilgili bir protein olan NMDA5, IRF5 dimerizasyonunu tetiklememiştir.
Bis-Tris gradyan jellerin kullanımı, büyük olasılıkla IRF5 monomerik ve dimeric formları ayrılmasına izin bu jel elektroforetik sistemlerin özel pH ve kimyasal bileşimi nedeniyle çok önemlidir. Ayrıca, denatüre olmayan yerli numune tamponunda hücre lysatlarının lysing ve korunması yerli protein yapılarını korur. Burada yerli PAGE asitleri için özel bir ticari olarak kullanılabilir bir kullanılır.
Bu büyük ölçüde iltifat ek bir yöntem, IRF5 nükleer translokasyon değerlendirmek için ImageStream görüntüleme akış sitometri sistemi kullanmaktır, hangi madde dir Ki dimerizasyon sonra IRF5 aktivasyonu. Protokolümüzle birleştirildiğinde, IRF5 etkinleştirmesinde yer alan adımları doğrulamak için başka bir tür test görevi göredehizmet eder. Inflamatuar yanıt önemli bir düzenleyici olmak, IRF5 enfeksiyon ve bağışıklık önemli bir rol oynar, otoimmün hastalıklar, kanser, ve diğer birçok hastalık insan sağlığı için önemli.
IRF5 ve ilgili transkripsiyon faktörlerini hedef alan terapötiklerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar da vardır. Bu protokol, çeşitli alanlardaki araştırmacıların IRF5 biyolojisini anlamalarına ve araştırmalarına olanak sağlayacaktır.
