Il nostro metodo è significativo perché consente ai ricercatori di isolare e manipolare diversi tipi di cellule per l'indagine dei loro contributi di lignaggio individuali alla forma e alla funzione dei tessuti. Questa tecnica è un metodo delicato ed efficiente per separare i tipi di cellule e, di conseguenza, l'integrità delle celle viene preservata per le impostazioni cultura 3D. Questa tecnica può anche essere applicata ad altri sistemi per isolare le cellule che non hanno biomarcatori ben caratterizzati.
Per raccogliere le ghiandole mammarie numero due, tre, quattro e cinque da un topo femmina di 10-14 settimane, prima fai un'incisione di un centimetro sulla linea mediana tra i due arti posteriori. Estendere il taglio fino al collo e fare piccoli tagli laterale dall'incisione della linea mediana verso gli arti. Quindi allungare la pelle insegnata prima di fissarla con un perno su ciascun lato dell'animale.
Usando le forcep, raccogliere i linfonodi dalle ghiandole numero quattro. Per rimuovere le ghiandole mammarie, utilizzare forbici affilate per tagliare sotto ogni regione del tessuto, posizionando i tessuti in 50 millilitri di quattro gradi Celsius DMEM-F12 integrati con 5%FBS e antibiotico-antimicotico man mano che vengono raccolti. Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, tritare le ghiandole fino a quando i pezzi possono adattarsi facilmente attraverso una punta della pipetta di un millilitro ruotando la piastra se necessario in modo che tutti i tessuti siano tritati uniformemente.
Quindi trasferire i frammenti in tre millilitri di mezzo di digestione in un unico pozzo di un piatto di adesione a sei pozzi per 14 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. La mattina dopo, pipettare delicatamente i tessuti 10 volte con una micropipetta da un millilitro e trasferire i frammenti di tessuto in un tubo da 15 millilitri. Raccogliere il tessuto per centrifugazione e rimosogliere il pellet in cinque millilitri di DPBS fresco.
Filtrare la sospensione attraverso un filtro a celle in nylon pre-bagnato da 70 micrometri, risciacquando il tubo nel filtro quattro volte con 10 millilitri di 37 gradi Celsius DMEM-F12 per lavaggio. Per rilasciare i frammenti di tessuto, tenere la linguetta del colino con le dita guantate e invertire il colino su un piatto di coltura tissutale di 60 millimetri. Passare quattro aliquote di un millilitro di mezzo di manutenzione attraverso il fondo del colino ed esaminare rapidamente il piatto per singole cellule, goccioline di grasso e tessuto contaminante al microscopio invertito.
Quindi posizionare il piatto nell'incubatrice di coltura cellulare per 24 ore per consentire ai frammenti di tessuto di aderire al piatto e generare frammenti bistrati. Per separare le cellule mioepiteliali dalle cellule epiteliali luminali, sciacquare il piatto con un millilitro di DPBS prima di aggiungere un millilitro di fresco 0,5% di tripside-EDTA alle cellule. Monitorare attentamente la digestione al microscopio invertito.
Lo strato esterno delle cellule mioepiteliali inizierà a staccarsi entro tre o sei minuti. Quando le cellule mioepiteliali si sono staccate, trasferire il supernatante in un tubo da 15 millilitri contenente due millilitri del 10%FBS in DPBS. Senza disturbare le cellule epiteliali luminali, sciacquare delicatamente il piatto con due millilitri di DPBS prima di aggiungere un millilitro fresco di tripside-EDTA alle cellule rimanenti.
Dopo sette-15 minuti, dissetare la reazione enzimatica con due millilitri del 10%FBS in PBS e trasferire le cellule in un nuovo tubo da 15 millilitri. È fondamentale monitorare da vicino le cellule durante la trippsinizzazione differenziale e non digerire e più volte le cellule. Una volta raccolte entrambe le frazioni, centrifugare le cellule per rimuovere qualsiasi reagente di dissociazione residua e rimosogliere il pellet in 250 microlitri di mezzo di manutenzione per tubo.
Dopo il conteggio, diluire ogni popolazione cellulare a 1,2 per 10 fino alle quattro cellule per concentrazione di pozzo in mezzo di manutenzione fresco. Aggiungere 90 microlitri di matrice extracellulare al 50% in DMEM-F12 senza rosso fenolo a ciascun pozzo di uno scivolo da camera a otto porri. Quando tutti i pozzi sono stati rivestiti, solidificare lo strato di base nell'incubatore di coltura cellulare per 30 minuti.
Durante questa polimerizzazione, raccogliere le frazioni cellulari per centrifugazione e rimostrare ogni popolazione in 100 microlitri di matrice extracellulare al 10% in mezzo di crescita del 90% per pozzo. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di ogni sospensione cellulare a ciascun pozzo e consentire alle co-colture di stabilirsi per 20 minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Alla fine dell'incubazione, aggiungere con cura 100 microlitri di mezzo di crescita lungo il lato di ogni parete della camera e riportare lo scivolo all'incubatore di coltura cellulare.
Immagini le cellule ogni 24 ore per monitorarne la crescita e rinnovare delicatamente il mezzo di crescita ogni due o tre giorni. Per fissare gli organoidi per l'immunostaining, nel momento sperimentale appropriato, aspirare accuratamente il mezzo da ogni diapositiva per essere immaginato e risciacquare ogni bene con 200 microlitri di DPBS per pozzo. Fissare gli organoidi con 200 microlitri di quattro gradi Celsius paraformaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente prima di trattare gli organoidi con 200 microlitri dello 0,2% di glicina in DPBS per pozzo per 30 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, permeabilizzare gli organoidi con 0,25%tritone X-100 in DPBS per 10 minuti a temperatura ambiente seguita dal blocco del legame non specifico con siero di asino al 5% o dal siero appropriato che corrisponde alla specie dell'anticorpo secondario in DPBS per un'ora con il dondolo. Quindi etichettare le cellule con da 125 a 200 microlitri degli anticorpi primari appropriati di interesse nel siero d'asino all'1% in DPBS durante la notte a quattro gradi Celsius con dondolo. La mattina dopo, lavare ogni bene due volte con 200 microlitri di DPBS più tritone X-100 prima di etichettare gli organoidi con gli anticorpi secondari coniugati a fluorescenza appropriati per 45 minuti a temperatura ambiente con dondolo protetto dalla luce.
Quindi lavare ogni bene due volte con DPBS fresco più tritone X-100 come dimostrato e immagini gli organoidi con microscopia a fluorescenza secondo protocolli standard. Dopo 24 ore di incubazione, frammenti epiteliali purificati hanno aderito al fondo del piatto di coltura formando strutture piatte simili a pancake con uno strato esterno di cellule mioepiteliali che circondano uno strato interno di cellule epiteliali luminali. Il trattamento con tripsiderina stacca differenzialmente le cellule con le cellule mioepiteliali che si staccano per prime e appaiono come cellule arrotondate luminose che circondano il nucleo delle cellule epiteliali luminali cuboidiche rimanenti.
La purezza complessiva dei due compartimenti cellulari è di circa il 90%, come valutato dall'espressione cheratina-14 ed E-cadherina all'interno delle due popolazioni. Dopo 10 giorni di coltura in matrice extracellulare al 10% su una base di matrice extracellulare del 50%, come dimostrato, gli organoidi delle cellule epiteliali luminali mioepiteliali formavano grandi strutture ramificate con lumen ben sviluppati. La differenziazione al quinto giorno con l'aggiunta al mezzo di alveologenesi induce la formazione di organoidi più grandi e ramificati contenenti latte.
È importante ricordare di lavare attentamente il colino durante la raccolta dell'epitelio per assicurarsi che non ci siano contaminanti stromali. Per interrogare i cambiamenti nell'espressione genica, i ricercatori possono raccogliere l'RNA dagli organoidi rilasciandoli dalla matrice extracellulare utilizzando una soluzione di recupero. La paraformaldeide è considerata pericolosa e i ricercatori dovrebbero utilizzare dispositivi di protezione individuale e lavorare all'interno di una cappa dei fumi quando utilizzano questo reagente.
