Bu protokol, araştırmacıların, beslenme bağışıklığı adı verilen bir süreçle sınırlı olan metal olan memeli konakta bulunanları daha yakından taklit eden koşullar altında yetiştirilen bakterileri analiz etmelerini sağlar. Bu protokol, metal kısıtlı koşullar altında tutarlı tekrarlanabilir bakteri büyümesini kolaylaştırır ve bakterilerin birçok farklı türde büyüme için adapte edilebilir. Deneye başlamadan iki gün önce, dondurucu stoklarından 37 santigrat derecede en fazla 24 saat kuluçka için GC orta plakalara gonokok seri.
Büyüme deneyinden 14 ila 16 saat önce, taze GC orta tabaklara tek koloniler koyun. Deney günü, bir asit yıkanmış 125 mililitre baffled yan kol şişesi beş ila 10 mililitre CDM ekleyin ve bir Klett kolorimetre boş bu orta kullanın. Sağlıklı tek kolonilerden 20 Klett cdM birimini aşılamak için steril pamuk uçlu bez kullanın.
Sıvı büyüme tahlilleri için 96 kuyu plakaları içine alt kültür için sağlıklı bir Neisseria gonorrhoeae inoculum üretimi tüm downstream deneylerin başarısı için çok önemlidir. Kültürleri dakikada 250 devirde 37 derecede kuluçkaya yatırın, bir ila iki saat kadar bir kütle ikiye katlayarak kültürleri ilk kültür yoğunluğunun yarısına ulaşmak için yeterli CDM hacmiyle seyreltin. Sonra, titreyen kuvöze kültürü geri dönün.
Metal yüklü proteinleri hazırlamak için, %30 demir doygunluğu elde etmek için mililitre insan transferrin çözeltisine 10 miligramlık bir fosforçözelti ekleyin. %25 doygunluk elde etmek için protein çözeltisine %15 molar oranında ilgi metalini ekleyin. Bir diyaliz kaseti için metal yüklü protein eklemek ve oda sıcaklığında dört saat boyunca diyaliz tampon iki litre karşı diyaliz için bir şırınga kullanın.
Daha sonra, dört derece santigrat derece diyaliz tampon iki litre kaset hareket ettirin ve herhangi bir bağlı metaller kaldırmak için dört derece Santigrat gecede diyaliz. Kitle iki katına sırasında, PBS ile ilgi biraz seyreltik 10X ön karışımları. Seyreltilmiş ön karışımların 15 mikrolitresi ile 96 kuyulu bir mikroplakanın kuyularını önceden tedavi edin ve boş kontroller için üç kuyunun her birine 10 mikrolitre 10 x ön karışım ve 90 mikrolitre CDM ekleyin.
Yan kol şişesindeki kültürler iki katına çıktıktan sonra, her kültürün 100 mikrolitresini mikroplakadaki kullanılmayan bir kuyuya ekleyin ve optik yoğunluğu 600 nanometre de ölçün. Kültürleri 0,02 nano00 nanometre lik optik bir yoğunluğa getirmek için gereken doğru seyreltme miktarını hesapladıktan sonra, küçük kültür tüplerinde CDM ile kültürleri seyreltin ve 10X ön karışımları plakadaki 1X'e seyreltmek için yeterli hacim ekleyin. Daha sonra, istenilen deneysel aralıklarla 600 nanometre okumalarda optik yoğunluk elde etmek için sallayarak sekiz ila 12 saat boyunca bir plaka okuyucu plaka yerleştirin.
Kitle iki katına kuluçka sonra, geri CDM üç cilt ile kültürleri seyreltmek ve ilgi metal tedaviler ekleyin. Sonra, kültürleri 37 derecede dört saat sallayarak kuluçkaya yatırın. Dört saat işareti kısa bir süre önce, filtre kağıdı ve yaklaşık boyutuna bir nokta-blot aparatı sığacak şekilde bir nitroselüloz parçası üç adet kesti.
Nitroselülozun altında filtre kağıdı ile cihazı monte etmeden önce nitroselülozun deiyonize suda yaklaşık 10 dakika bekletilmesi. Kuluçka sonunda, hücre yoğunluklarını kaydedin ve yoğunlukları uygun bir nihai yoğunluğa göre standartlaştırın. Sonra, pipet nitroselüloz üzerine hücre kültürleri.
Filtre kağıdı sıvının tamamını emdiğinde cihazı sökün ve lekenin kurumasını bekleyin. Uygun bir engelleme çözeltisi ile nitroselüloz membranını bir saat boyunca bloke edin ve nitroselülozun altında sızıntı yası oluşturmak için filtre kağıdını parafin filmle değiştirerek nokta-leke aparatı yeniden monte edin. Metal bağlayıcı ligand'ı blokerde 0,2 mikromolar ile seyreltin ve hücreleri orta derecede sallayarak bir saat boyunca incen.
Kuluçka sonunda, bir vakum ile sıvı sifon, leke yıkayın ve sinyal geliştirmek için standart immünolojik prosedürleri izleyin. Değişken metal konsantrasyonlarında protein üretiminin Batı leke analizi TPEN tarafından çinko şelasyon yanıt çinko duyarlı dış membran tdfJ düzenlenmesi ortaya koymaktadır. Çinko ortama geri eklendiğinde TdfJ aslında tespit edilemez.
N.gonorrhoeae çinko yüklü calprotectin varlığında yetişir, hangi çinko duyarlı tdfH eylem gerektirir. Kullanılabilir çinko kaynağı olmadığında büyüme sınırlıdır. Dış membran taşıyıcısı tdfJ üretildiğinde tek çinko kaynağı olarak hizmet veren çinko S100 A7'nin varlığında da benzer sonuçlar gözlenmektedir.
CDM'de yetiştirilen gonokokit, tdfH üretirken ve çinko kıtlığı sonucu kalbenebini bağlayabiliyor. CdM'de yetişen kültürlerde de transferrinin bağlanmasının arttığı gözlenir, bu da CDM'nin daha demir tükenmiş yapısından dolayı daha yüksek protein ekspresyonunun göstergesidir. Bu protokol, açıklanan su kaynakları ile kullanılmak üzere optimize edilmiştir ve diğer şelatörler veya metaller ile ek titrasyon diğer su türleri kullanılırsa gerekli olacaktır.
Ek analiz için, bir metal tükenmesi veya metal dolu koşullar altında gen ekspresyonu çalışmaları için nicel metal alımı tahlilleri veya kantitatif RTPCR gerçekleştirebilirsiniz.
