Bu çalışma I. Davis için bir Wellcome Trust Kıdemli Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.

Diseksiyon için önce 1. Drosophila hazırlığı (E. Gavis, Princeton Üniversitesi Göre) <ol><li> Seyrek ekilmiş şişe yetişkin atın ve ° C deneme öncesinde 25 şişe aktarın. Yeni yetişkin çıkmaya başladı sonra, iki gün bekleyin. </li><li> Katı gıda yaklaşık 10 ml içeren bir sineğin şişeye atın ve 45 derecelik bir açı üzerinde kuru maya 0.5-0.7 gram (bkz. tablo) ekleyin. Maya ile sinek yiyecek tüm yüzeyi örtmeyin. </li><li> Hidrat (Şekil 1A) için yeterli, maya için su birkaç damla ekleme. 45 derece şişe yerleştirin ve maya için yaklaşık 3 dakika su (Şekil 1B) kadar emmek için izin verir. </li></ol> Not: Alternatif olarak, premix bir ayrı bir kapta yapıştırın maya ve bir spatula ile flakonuna salçayı ilave edin. <ol start="4"><li> CO 2 gazı enjekte edilerek şişe içinde sinekler uyutmak. Onlar hareket durdurduğunuzda, CO 2 üzerine bilinçsiz sinekler bahşiş </ssıralama (Şekil 1C) için ub&gt; sinek pad. </li><li> Ince uçlu bir boya fırçası (Şekil 1D) ile bir diseksiyon kapsamında 10-15 kadın ve istenen genotip 5 erkek izole edin. Erkeklerde claspers varlığında, bunların arka tarafında koyu renkli bir çıkıntı yapı ile belirgindir. </li><li> Mayalı flakon (Şekil 1E) seçilen sinekler ekleyin. 24-60 saat boyunca 25 ° C &#39;de yer. Orta aşamada yumurta odaları ve geç dönem yumurta odaları için daha uzun süreler için genç daha büyük bir yüzde daha kısa sürelerde inkübe edin. </li></ol> 2. Drosophila over diseksiyonu <ol><li> Bir No 1,5, 22 x 50 mm kapak kayma (Şekil 2A) üzerine halokarbon yağı, küçük bir damla yerleştirin. Bu şekilde olmayacak tarafına hazırlanmış kapak kayma ayarlanır. </li><li> Bir CO 2 ped üzerine CO 2 gazı ve ucu enjekte mayalı aşağılık içinde sinekler uyutmak. </li><li> (Değil tarihleri ​​arasında bireysel bir karnın ön az kadın besiye kavramak için keskin ince burunlu forseps kullanmae karın ve göğüs) (Şekil 2B-C). </li><li> Forseps ile kadın tutun ve kabaca 2-3 cm hazırlanmış coverslip yukarıda, bir mikroskop altında görmek. </li><li> Hala ön az tutarak, kadın aşırı posterior (Şekil 2D) de doku çıkarmak için forseps ikinci bir set kullanabilirsiniz. Not: Gut doku genellikle posterior ucundan dışarı çeker. Forseps kaldırıldı doku silin. </li><li> Hala ön kısmındaki kadın tutarken, yavaşça gerisinde ön çalışarak, karın sıkmak veya masaj sildi forseps kullanabilir. Bir tüp ucundan diş macunu kaldırılmasıyla aynı şekilde karın masaj yapın. </li><li> İki büyük opak yapıları forseps (Şekil 2E-F) ucundaki karın ve sopa ile itilmiş olacaktır. Bu eşleştirilmiş yumurtalıklar vardır. </li><li> Aşağıdaki slaytta halokarbon yağı üzerine yumurtalıklar dokunun. </li><li> (Figür coverslip üzerine yağda 4-6 yumurtalıkların toplam vermek için diseksiyon 1-2 kez tekrarlayıne 2G). </li></ol> 3. Yalıtımlı ovaryolleri Not: Her bir ovaryum bir dize 10 boncuk gibi dizilmiş farklı aşamalarında 6 ile 10 yumurta odalarından oluşan yaklaşık 16 ovaryolleri içerir. Not: Ön ovaryolleri izole etmek aydınlatma örnek sığ bir açıyla çarptığı, böylece mikroskop üzerinde ışık kaynağı ayarlayın. Bu örnek bir kontrast sağlar ve genç aşamada yumurta odaları görselleştirme sağlar. <ol><li> Yağ olarak, kapalı forseps (Şekil 3A) ile arka ucunu (eski aşamaları) azından bağlayan doku kaldırarak iki yumurtalık ayırmak. </li><li> Sağa sola ve genç sahneye en eski aşamaları ile Orient bireysel over. Overde genç aşamada yumurta odaları şeffaf ve yumurtalık daha sivri ucunu oluşturur. </li><li> Dominant el forseps bir çift ile, hafifçe tercihen th kalıntılarından, bir yumurtalık arka kavramake bağ dokusu. Forseps ile yerde over tutarken, bireysel ovaryolleri (Şekil 3B-D) didiklemek için (veya tungsten iğne) Bir kesme prob kullanın. </li></ol> Not: eski aşamalarında tam yumurtalıktan ayrılması için çok büyük olduğu gibi bireysel ovaryolleri genç aşamaları (germarium 10 sahneledi) arasında kıracak. Not: diseksiyon prob ile geç evre oosit batırılarak yağ sızması sitoplazma neden ve bireysel ovaryolleri çıkarılması çok zor hale getirecek. Geç bir aşamada oosit delinirse, taze bir yumurtalık taşımak. <ol start="4"><li> Ovariole over ücretsizdir sonra, deneme için istenen yönde yağ damlası ve doğunun merkezine sürükleyin diseksiyon prob kullanın. Not: yağda ovaryolleri yerleşmek ve cama yapışır. </li><li> 15-25 bireysel ovaryolleri kadar bu süreci (3,3-3,4) tekrarlayın. Not: Bu multip diseksiyonu gerektirebilirle yumurtalıklar. Tüm süreç 15 dakikadan az sürer. </li></ol> Not: Daha çok deney için sineklerin n sayısını artırmak için daha az sinek her iki yumurtalık diseksiyon daha birçok sineklerden bir yumurtalık her teşrih tavsiye edilir. Not: ovariole Kaba işleme sağlıksız oosit neden olur ve deneyde eserler yol açabilir. Not: Oosit over (F Şekil 7E karşılaştırın) diseke edildikten sonra 40 dakika stres nedeniyle fenotipik değişiklikleri görüntülemek için başlayacaktır. <ol start="6"><li> Bir kez ovaryolleri yeterli bir oryantasyon (Şekil 3E) vardır, yağ fazlalığı yumurtalık dokusu dışına taşımak için diseksiyon prob ve kapalı forseps kullanabilir. Bu malzeme bir kağıt havlu üzerine forseps silinebilir. </li></ol> 4. Yalıtımlı bireysel geç dönemde yumurta odaları (E. Gavis, Princeton Üniversitesi Göre) <ol><li> Domin forseps bir çift ilekarınca yandan, tercihen bağ dokusunun kalıntıları tarafından, izole edilmiş bir yumurtalık posterior kavramak. Forseps ile yerde over tutarken, forseps yakın over (Şekil 4A) arka ucunu diseksiyon prob tanıtmak. Geç dönemde yumurta odacıkları arasındaki probu takarak herhangi bir yumurta odaları delinmesiyle kaçının. </li><li> Erken evre yumurta odaları (Şekil 4B) az çıktığında kadar over ile diseksiyon iğnesi çekin. Doğru yapıldığı zaman, sonda yer ovaryolleri ve geç dönem yumurta odaları tutan bağ dokusu kaldıracaktır. </li><li> Ovaryolleri coverslip üzerine serilen kadar 4.2 adımı yineleyin. Not: Yumurta odaları artık birbirlerinin üstüne yığılmış zaman, bu adımı tamamlandı. </li><li> Anatomi prob kullanarak, kolay görüntüleme (Şekil 4C) izin vermek için geç oosit ayırın. </li></ol> Not: İleri evre yumurta odaları diseksiyon sırasında bir oosit delme i diseksiyon gibi kınayan gibi değilgenç aşamaları için ndividual ovaryolleri. Not: Sahne 14 yumurta odaları için yönlendirme için dorsal uzantıları kavramak için forseps kullanabilir. 5.. Enjeksiyon hazırlığı Not: orta evre oositlerin enjeksiyon için, şark ovaryolleri dik kapak kayma uzun eksenine. <ol><li> [Olgumuzda Uygulamalı Hassas bir DeltaVision Çekirdek] görüntüleme mikroskop açın ve uygun görüntüleme ayarları (Şekil 5A-B) yükleyin. </li><li> Enjeksiyon aparatı (Şekil 5C) açın. </li><li> Bir yükleme ucu (Şekil 5D-E) ile enjeksiyon iğnesi yükleyin. Enjekte edilecek Çözümler enjeksiyon iğnesi engelleyebilir birikmeleri önlemek için yüksek hızda kısaca santrifüj edilmelidir. </li><li> Enjektör için yüklenen enjeksiyon iğnesi takın. Iğne (Şekil 5F) bozulmaması için özen gösterin. </li><li> Tıkanıklıkları açar iğne yardımcı olmak için, bir kesik veya kırık coverslip bir cam 2x10 mm&#39;lik küçük bir parça yerovaryolleri içeren yağ damla t bir tarafı. Bu cam parçası petrole bulanmış olduğundan emin olun. Bu cam iğne kırılma veya tıkanıklıkları açar için karşı ram iğne ucu kadar hizmet verecek. </li></ol> 6. Floresan RNA Enjeksiyon Başlamadan önce: enjeksiyon cihazı ve bir iğne görüş alanının merkezi üzerinde konumlandırılmış bu tür mikro-manipülatör kontrolleri ayarlayın. <ol><li> Mikroskop sahnede enjekte edilecek örnek monte edin. </li><li> 20x hedefi seçin. Daha yüksek veya daha düşük bir büyütme amaçları da kullanılabilir. </li></ol> Not: nokta Ziyaret yeteneği ile otomatik bir sahne kullanılarak Eğer enjeksiyon için 8-9 oosit başlamadan önce tüm sahneye işaretlemek için tavsiye edilir. Bu kolay Ziyaret ve seçilmiş oosit enjeksiyon için izin verir. <ol start="3"><li> Bu yağ değene kadar enjeksiyon iğnesi indirin. Objektif lens üzerinden Merkezi&#39;nde iğne ucu. </li><li> ÇevirmekOdanın lambalarını kapatın ve mikroskop için parlak alan ışığı açın. İşaretli noktaları listesinde ilk noktaya (oosit) seçin. Oküler bakarken, oosit (Şekil 6A) odaklanır. </li><li> Bu oosit ve oosit görünür gelecek gibi odak aynı düzlemde kadar elle iğne indirin. </li><li> Bunun içindeki yumurta olduğu kadar, manipülatör kullanılarak kontroller, enjeksiyon iğne noktası hareket eder. Hızlı bir bıçaklama hareketi genellikle yavaş bir ilerleme daha başarılı olur. İçeri girdikten sonra, iğnenin küçük bir hacim çıkarın ve görsel etkilerinin değerlendirilmesi, gerektiği gibi tekrarlayın. Enjeksiyon başarılı olursa bu, tekrar belirgin değilse, oosit içine sitoplazma, yerinden edilecektir. Bu malzeme enjekte edilmiş olup olmadığını belirlemek üzere floresans görüntü için gerekli değildir. Enjeksiyondan sonra, oosit (Şekil 6B-G) içindeki iğne çıkarılır. </li><li> Enjekte edilen sıvı miktarını kesin olarak ölçmek için zordur. Enjekte edilen hacim, adju artırmak içinenjeksiyon nabız basıncı veya zaman st, biraz açılış artırmak veya tekrarlanan enjeksiyon darbeleri kullanmak iğne ucu bölünürler. </li></ol> Not: düzgün çalıştırıldığında tüm enjeksiyon işlemi 10 saniyeden daha az almalıdır. Bıçaklama veya oosit için iğne içinde olan kalıcı kapsamlı yumurta odasına ciddi hasara neden olur. <ol start="8"><li> Sonraki işaretli oosit seçmeden önce, böylece seyahat yoldaki diğer oosit temas etmeyecek yağ enjeksiyon iğnesi yeterince yüksek yükseltmek. </li><li> Yeni oosit anda, adım 6.6 tekrarlayın. Gerekli tüm oositler enjekte kadar bu sekilde devam ediyor. </li></ol> Not: katarken, bir hata yapılırsa, sonraki işaretlenmiş oosit geçmek. Hasarlı oositlerde zaman kaybetmeyin. Not: iğne enjeksiyonu oturumu sırasında tıkanmış olabilir. Bu durumda, coverslip üzerindeki yağ içinde cam parçası kırık iğne bitişik hareket eder. Zekâh aynı odak düzlemi içinde cam ve iğne, yavaşça cam (Şekil 6H) içine iğne koç. Iğne enjeksiyon düğmesini iterek ve herhangi bir sıvı çıkar iğne ucu olmadığına bakarak unclogged olduğunu test edin. <ol start="10"><li> Tüm oositler enjekte edilmiştir zaman, elle mikroskop için ışın yolu petrol ve şark dışarı dışarı, iğne yukarı hareket ettirin. Bunu göz hasarı önlemek için, güvenli bir yönelim olduğundan emin olun. </li></ol> Not: Uzun bir süre yumurta odasına izolasyon ve oosit enjeksiyon arasında geçmiş ise, oosit stresle ilişkili fenotipik değişiklikler ekleme ve sergilemek zor olacak. Benzer sorunları oosit veya aşırı hacimli enjeksiyon (Şekil 6i karşılaştırmak, J, K) kaba işleme ile ortaya çıkabilir. 7. Görüntüleme deneysel tasarım Canlı <ol><li> Listeden ilk enjekte oosit seçin. Enjeksiyon floresans görüntüleme bir çerçeveden (a tarafından yumurta içinde olduğu TestiŞekil 6g s). </li><li> Dalgaboyu, emisyon yolu, uyarılma süresi, Z-yığını ve koleksiyonları arasında zaman: dahil, deneysel parametreleri, yapılandırın. Not: Bu ile ilgili daha fazla bilgi için bkz: Parton R., ve ark. (2010) 2. </li><li> Veri seti toplayın. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Alexa-546 GRK RNA sentez in vitro bir Me31B :: GFP yumurta haznesi (Şekil 7A) içine enjekte edildi. RNA oosit dorsal anterior lokalize ve çekirdeğin etrafında bir kap (Şekil 7B) oluşturur. RNA yerelleştirme daha fazla örnek için MacDougall N., ve ark. (2003) 11. Floresan etiketli proteini (Tau-GFP, Şekil 7C) veya RNA etiketleme sistemleri (GRK * mCherry, Şekil 7D) ifade Orta ve geç evre oosit enjeksiyonu olmadan görüntülenebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> Şekil 1.. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> Şekil 2. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> Şekil 3. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> Şekil 4. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> Şekil 5. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> 6 Şekil. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> Şekil 7.

<ol>
	<li>Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+and+the+development+of+biology+in+the+20th+century.">Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century.</a> Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).</li><li>Parton, R. M., Valles, A. -. M., Dobbie, I. D., Davis, I., Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Limits+of+Live+Cell+Imaging+in+Drosophila.">Pushing the Limits of Live Cell Imaging in Drosophila.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory. , 387-418 (2010).</li><li>Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+messages:+the+intracellular+localization+of+mRNAs.">Moving messages: the intracellular localization of mRNAs.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (5), 363-375 (2005).</li><li>Jansen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Message+on+the+Move.">mRNA Localization: Message on the Move.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 247-256 (2001).</li><li>Van De Bor, V., Hartswood, E., Jones, C., Finnegan, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gurken+and+the+I+factor+retrotransposon+RNAs+share+common+localization+signals+and+machinery.">gurken and the I factor retrotransposon RNAs share common localization signals and machinery.</a> Dev. Cell. 9 (1), 51-62 (2005).</li><li>Delanoue, R., Herpers, B., Soetaert, J., Davis, I., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Squid&#47;hnRNP+helps+Dynein+switch+from+a+gurken+mRNA+transport+motor+to+an+ultrastructural+static+anchor+in+sponge+bodies.">Drosophila Squid&#47;hnRNP helps Dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies.</a> Dev. Cell. 13 (4), 523-538 (2007).</li><li>Jaramillo, A. M., Weil, T. T., Goodhouse, J., Gavis, E. R., Schupbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+fluorescently+labeled+endogenous+gurken+mRNA+in+Drosophila.">The dynamics of fluorescently labeled endogenous gurken mRNA in Drosophila.</a> J. Cell. Sci. 121 (Pt. 6), 887-894 (2008).</li><li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+endogenous+mRNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila.">Live imaging of endogenous mRNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr. Biol. 13, 1159-1168 (2003).</li><li>Bertrand, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol. Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 1-70 (1993).</li><li>MacDougall, N., Clark, A., MacDougall, E., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+gurken+(TGFalpha)+mRNA+localizes+as+particles+that+move+within+the+oocyte+in+two+dynein-dependent+steps.">Drosophila gurken (TGFalpha) mRNA localizes as particles that move within the oocyte in two dynein-dependent steps.</a> Dev. Cell. 4 (3), 307-319 (2003).</li><li>Tekotte, H., Tollervey, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+migrating+border+cell+cluster+in+living+Drosophila+egg+chambers.">Imaging the migrating border cell cluster in living Drosophila egg chambers.</a> Dev. Dyn. 236 (10), 2818-2824 (2007).</li><li>Weil, T. T., Parton, R., Davis, I., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+bicoid+mRNA+anchoring+highlight+conserved+mechanisms+during+the+oocyte-to-embryo+transition.">Changes in bicoid mRNA anchoring highlight conserved mechanisms during the oocyte-to-embryo transition.</a> Curr. Biol. 18, 1055-1061 (2008).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

<html> Canlı hücre görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücresel süreçler incelenmesi için güçlü bir tahlil oluşturmaktadır. Basit parlak saha gözlem ek olarak, proteinler ve ilgi RNA&#39;lar için flüoresan etiketlerin Ayrıca çok önemli gelişmeler yol açmıştır. Burada genetik ve biyokimyasal testler ile birlikte kullanılabilir görüntüleme bireysel yaşam oositler için bir protokol özetlediğim. Bu protokol, biz de deneysel enjeksiyon yoluyla yaşam oosit işlemek için nasıl açıklayabilir. Doğrudan bir RNA Lokalizasyon (Ball ve Davis, yayınlanmamış) ve proteinlerin 6 işlevini inhibe antikorlar deneyi için ikincil bir yapının özelliği flüoresan etiketli RNA sentez in vitro dahil olmak üzere enjekte etmek için malzeme için pek çok olasılık, bulunmaktadır. Gelecekteki çalışmalar olasılıkla diğer etiketleme bileşenleri ve moleküler mekanizmaları test edilmesi sağlanarak yaşam oosit hücresel makine tanıtımı göreceksiniz. t &quot;&gt; canlı hücreler çalışırken dokusunun canlılığını ve sağlık esastır. korunması bu protokol, biz yumurta odasının strese yol açabilecek bir dizi adım işaret. Örneğin, petrol görüntüleme için üstün olmasına rağmen, petrol genişletilmiş kültür yumurta odasında stres neden olabilir. Bu kolay (Figure7F için Şekil 7E (stressiz) karşılaştırmak (stres altında deforme ve bleb edecek nükleer morfoloji ve konumu, oosit zarı inceleyerek parlak alan maruziyeti altında izlenebilir )) vurguladı. Sahne 9 yumurta odaları RNA lokalizasyon ve çoklu saat boyunca sınır hücre migrasyonu 12 gösteriyor. Ancak, bir sahne 7/8 yumurta odasına kaldırılıyor over yaklaşık 40 dakika sonra halo karbonlu yağ kötü etkileri sergilemeye başlayacak kadın. Geç aşamada yumurta odaları, 14 sahne 11, çünkü bu aşamalar 13 folikül hücrelerinden yumurta kabuğu salgılanması yağı veya sulu ortam ya da normal gelişebilir. Bu repo oldusulu böcek orta insülin Ayrıca 6 saate 14 ve germaria kadar 14 saat 15 için sahne 9 oosit koruyabilirsiniz rted. Bu oosit vurguluyor ve canlılığı azaltır gibi tüm durumlarda, yumurta odasının agresif manevralar, kaçınılmalıdır. Görüntüleme yumurta odaları az ve tedavi etmek için özen her yavaşça optimum canlılığı sağlamak için en iyi yoldur.

Diseksiyon kullanılan araçlar temiz olmalıdır ama otoklavlanabilir gerekmez. ETOH ile araçları silin ve onları başından önce kurumasını bekleyin. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> İnce uçlu bir boya fırçası (Sanatçılar Sable, yuvarlak, büyüklüğü 00 veya 0) </td><td> Çoğu sanat malzemeleri çıkışlarından Mevcut </td><td></td><td> İyi bir fırça önemlidir </td></tr><tr><td> Halokarbon Ürünleri A.Ş., Seri 95 </td><td> Halokarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 </td><td></td><td> Avrupa dağıtıcısı: Solvadis (GMBH) Yağ ile hava gazı ile oksijen emin olun. </td></tr><tr><td> Slip-Hayır örtün. 50mm 1,5, 22 x </td><td> Uluslararası-No1-VWR Cat = 631-0137-22-50mm </td><td> Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 - Dumostar </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot; ucu da iyi ama daha kırılgan </td></tr><tr><td> Prob Kesme </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Kesme </td><td> Olympus </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 pad </td><td> Üzerinden kullanılabilir <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (Genesee Bilimsel bir bölümü) </td><td> 59-114 (789.060 Dutscher) </td><td> Avrupa dağıtıcısı: www. dutscherscientific. com</a> / Özel kendi sinek yastıkları inşa etmek de nispeten kolaydır </td></tr><tr><td> KimCare </td><td> Kimbery Clark-KimCare Medikal mendil </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop-DeltaVision </td><td> Uygulamalı Hassas </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipülatör </td><td> Burleigh mikromanipülatörler Lümen Dynamics Grup inc gelen. 2260 Argentia Road, Toronto, Ontario, L5N 6H7 Kanada </td><td> Burleigh PCS-5000 serisi, TS-5000-300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (Eski adıyla Exfo) </td></tr><tr><td> Enjeksiyon aparatı </td><td> TriTech Research, Inc 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 </td><td> MINJ-1 </td><td> Eppendorf Femptotips almak için bir tutucu ile Modifiye </td></tr><tr><td> Enjeksiyon iğne </td><td> Eppendorf Steril Femtotips I ve II </td><td> 930000043 </td><td> Farklı ipuçları farklı uygulamalar için daha iyi </td></tr><tr><td> Ipuçları 20μl Yükleniyor </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Kuru aktif maya </td><td> Fleischmann Mayası </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparing individual drosophila egg chambers for live imaging

Canlı hücre görüntüleme gibi eksen özellikleri, hücre farklılaşması ve organogenez 1 gibi konuları araştırmak için model olarak kullanılan Drosophila dokuların bir dizi uygulanan önemli bir tekniktir. Deney örneklerinin Doğru hazırlık çok önemli, ihmal, bir adımdır. Hazırlık amacı fizyolojik uygunluğu sağlamak ve optimal görüntüleme koşulları oluşturmaktır. Doku canlılığını korumak için, dehidratasyon, hipoksi, aşırı ısınma veya orta bozulma 2 önlemek için önemlidir. Drosophila yumurta odası beden desenleme, mRNA lokalizasyon ve hücre iskeleti organizasyonu 3,4 ile sınırlı ilişkin soruları inceleyerek değil, iyi kurulmuş bir sistemdir. Erken ve orta dönem yumurta odaları için, halokarbon petrol montaj bu, oksijen serbest difüzyon sağlar dehidratasyon ve hipoksi önler ve mikroskopi için mükemmel optik özelliklere sahip olduğunu hayatta kalmak için iyidir. Imfloresan proteinlerin yaşlanma yumurta odası veya etiketli RNA, protein ya da 5-7 antikorların fiziksel enjeksiyon transgenlerin getirilmesi ile mümkündür. Örneğin, hayvanların genomuna MS2 yapıları Ayrıca yumurta 8&#39;de mRNA&#39;lar gerçek zamanlı gözlem sağlar. Bu yapıları da 9 kat protein ile MS2 bakteriyofaj RNA kök döngü etkileşim kullanımı yoluyla mRNA in vivo etiketleme için izin verir. Burada, biz de dişi Drosophila tek tek ovaryolleri ve yumurta odaları izole olarak yumurtalıkların çıkarılması için bir protokol mevcut. Drosophila oogenez see Allan C. Spradling (1993, 2009 basıldı) 10 ayrıntılı bir açıklama için.

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging at JoVE.com

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta oda mRNA lokalizasyon mekanizmaları eğitim için mükemmel bir modeldir. Lokalizasyon ve süreçlerini desteklemek dinamik olayları yakalamak için, canlı dokuda hızlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü görüntüleme gereklidir. Burada, diseksiyon ve minimum kesinti ile canlı örnekleri görüntüleme için bir protokol mevcut.

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

preparing-individual-drosophila-egg-chambers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

19.1K Görüntüleme.  University of Oxford.  Drosophila Yumurta oda mRNA lokalizasyon mekanizmaları eğitim için mükemmel bir modeldir. Lokalizasyon ve süreçlerini desteklemek dinamik olayları yakalamak için, canlı dokuda hızlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü görüntüleme gereklidir. Burada, diseksiyon ve minimum kesinti ile canlı örnekleri görüntüleme için bir protokol mevcut.

Video: Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biyoloji

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Hasat ve hazırlanması Drosophila</emElektrofizyolojik Kayıt ve Diğer İşlemler> Embriyolar

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Bireysel hazırlanması Drosophila Yumurta Chambers