Makromoleküler kalabalık tekniğini kullanarak hücrelerin in vivo deneyim çevresini taklit etmek için bireysel kollajen açısından zengin bir model oluşturduk. Cilt zaten in vitro hücreleri büyümek için kullandığımız sıvı ortamın aksine, kalabalık bir ortamdır. Geleneksel monolayer hücre kültür sistemi ile karşılaştırıldığında, bu model hücrelerin in vivo deneyim kalabalık moleküler ortamı yeniden oluşturur, özellikle bol hücre dışı matris sıvı su yerinden skar dokularında.
Hipertrofik yaraların yanı sıra, bu makromoleküler kalabalık tekniği pulmoner fibrozis gibi ekstrasellüler matriksbol olduğu çalışmalarda kullanılabilir. El yazması yönlere göre yara ve normal fibroblastlar büyütün. Sonra 50, 000 hücre de orta bir mililitre başına 24 kuyu plakaları içine tohum.
Plakayı bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Ficoll 70, Ficoll 400 ve askorbik asidi %10 FCS DMEM'e karıştırarak makromoleküler kalabalık veya MMC ortamını hazırlayın. Kalabalığı çözeltiye dağıtmak için medyayı su banyosunda kuluçkaya yatırın.
Sonra 0.2 mikrometre filtre ile sterilize. Harcanan ortamı fibroblastlardan aspire edin ve yeni yapılmış MMC media ile değiştirin. Hücreleri altı gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın, her üç günde bir MMC ortamını değiştirin.
Bir mililitre asetik asit ile 200 mililitre distile deiyonize su damıtılmış kırmızı 80 tozu 0,2 gram eriterek bir Sirius Red çözeltisi hazırlayın. MMC ortamını hücrelerden aspire edin ve her kuyuya 300 mikrolitre Sirius Red çözeltisi ekleyin. Sonra hücreleri 90 dakika boyunca kuvöze geri verin.
Kuluçkadan sonra, Sirius Red çözeltisini musluk suyuyla hafifçe durulayın ve plakanın bir gecede kurumasını bekleyin. Ertesi gün, her kuyuya 0,1 molar sodyum hidroksit 200 mikrolitre ekleyerek ve 5 ila 10 dakika boyunca plaka sallayarak Sirius Kırmızı ayıklayın. Çıkarılan lekenin 100 mikrolitresini şeffaf bir 96 kuyu plakasına aktarın ve emiciliği mikro plaka okuyucusuyla 620 nanometrede ölçün.
Her kuyuyu 200 mikrolitre PBS ile yıkayın ve hücreleri 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca metanolile düzeltin. Sonra kuyulara% 3 BSA ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca plaka kuluçka. Engelleme çözeltisi aspire ve her kuyuya 200 mikrolitre anti-kollajen bir antikor ekleyin.
Plakayı 90 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra antikor aspire ve yıkama başına beş dakika PBS ile üç kez kuyuyıkama. Her kuyuya 200 mikrolitre Keçi Anti-Rabbit-FITC İkincil Antikor ve DAPI ekleyin.
Alüminyum folyo ile plaka kapağı ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Sekonder antikor ve DAPI'yi atın ve pbs ile yıkar. Sonra floresan doğrudan bir mikroskop altında görselleştirin.
Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, her kuyuya 40 mikrolitre lysis tamponu ekleyin ve hücre tabakasını pipet ucuyla kazıyın. Daha sonra protein konsantrasyonu ölçmek için mikro santrifüj tüpler içine protein lysate aktarın. 4 ila %12 Bis-Tris protein jelinin her kuyuya 10 mikrogram protein yükleyin ve SDS-PAGE'i 200 voltta 30 dakika boyunca gerçekleştirin.
Bittiğinde, 90 dakika boyunca 90 volt bir batı leke çalıştırarak bir nitroselüloz membran protein transferi, jel ve membran arasında kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat. 10 mililitre bloke tampon ile membranı kapatın. Sonra bir gecede dört santigrat derecede birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, yıkama başına beş dakika için yüzde 0,1 TBS Tween 20 ile membran beş kez yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca türe uygun ikincil antikor ile membran kuluçka. Yıkıntıları tekrarlayın ve bir görüntüleme sistemi ile floresan görselleştirin.
Toplam RNA'yı ticari bir RNA ekstraksiyon kiti ile arındırdıktan sonra, mikro hacim spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ölçün. Sonra ilk iplikçik DNA sentezi gerçekleştirmek için bir cDNA sentez kiti kullanın. CDNA'yı 10 mikrolitre SYBR Green Supermix ile karıştırın ve örnekleri oligonükleotid astarlarla önceden kaplanmış özel bir 96 kuyu plakasına aktarın.
Toplam hacmi suyla kuyu başına 20 mikrolitreye ayarlayın ve el yazması talimatlara göre RT-PCR çalıştırın. Hipertrofik skar kaynaklı insan derisi fibroblastlarının hücre yoğunluğu Ficoll ile kültürden sonra PVP veya kontrol ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artmıştır. Ficoll ile %9 kesirli hacimdolulukta makromoleküler kalabalık, kollajen bir tanesi de dahil olmak üzere kollajen birikimini diğer formülasyonlara göre önemli ölçüde artırmıştır.
Bu daha nicel analiz ile gösterilmiştir. MMC ortamlarında yetiştirilen skar kaynaklı fibroblastlar ve normal dermal fibroblastların kollajene ek olarak ECM türlerinin ekspresyonunu düzenlediği bulunmuştur. Özellikle, matris metalloproteinazveya MDP'lerin yüksek bir ekspresyonu, yerli dokulara göre hipertrofik skar dokularında birikti.
Makromoleküler kalabalık koşullarda yetiştirilen her iki hücre kültüründe de MMP2, 9 ve 13 ekspresyonunun önemli ölçüde güncellendiği gözlenmiştir. Yara iyileşmesi ve yara oluşumunda, ECM montajı ve yeniden biçimlendirilmesinde MDP'ler önemli bir rol oynar. İnterlökin altı ve vasküler endotelyal büyüme faktörü sentezi batı lekesinde saptanamadı.
Ancak RT-PCR analizi interlökin altı ekspresyonunun önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini, vasküler endotelyal büyüme faktörüifadesinin ise MMC koşullarında ekili fibroblastlarda aşağı düzenlenmiş olduğunu ortaya koymuştur. Bu protokolü denerken, çok az CO patojeni olan dermal fibroblastları seçmek çok önemlidir. Biz de askorbik asit MMC orta önemli bir madde olduğunu akılda tutmak zorunda.
Biz özellikle daha fazla bu MMC modelinde kollajen birikimi ve hizalama tespit ilgileniyoruz. Bu in vitro modeli nin yerli skar dokuları ile karşılaştırması için gelişmiş mikroskobik teknikler kullanmayı planlıyoruz. Yardımcı modal dokuların in vitro özgünlüklerini geliştirmek için başkalarını bu makromoleküler kalabalık tekniğini kullanmaya teşvik ediyoruz.
Tabii ki, makromoleküler kalabalık da in vitro hastalık ve patoloji modellerini yeniden hesaplamak için kullanılabilir.
