우리는 세포가 거대 분자 밀집 기술을 사용하여 생체 내에서 경험하는 환경을 모방하기 위해 개별 콜라겐이 풍부한 모델을 만들었습니다. 피부는 우리가 이미 체외에서 세포를 성장하기 위하여 이용하는 액체 환경과는 달리 혼잡한 환경입니다. 전통적인 단층 세포 배양 시스템에 비해,이 모델은 세포가 생체 내에서 경험하는 붐비는 분자 환경을 재현, 특히 풍부한 세포 외 매트릭스가 액체 물을 대체하는 흉터 조직에서.
비대성 흉터 외에도 이 매크로 분자 밀집 기술은 폐 섬유증과 같은 세포외 매트릭스가 풍부한 연구에 사용할 수 있습니다. 원고 방향에 따라 흉터 유래 및 정상 섬유 아세포를 성장시다. 그런 다음 배지의 1 밀리리터에서 잘 당 50, 000 세포에서 24 개의 우물 판으로 시드하십시오.
밤새 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. Ficoll 70, Ficoll 400 및 아스코르브 산을 10% FCS DMEM에 혼합하여 매크로 분자 혼잡 또는 MMC 미디어를 준비합니다. 수조에서 미디어를 배양하여 군중을 해결책으로 분산시다.
그런 다음 0.2 마이크로미터 필터로 소독합니다. 섬유아세포에서 소비된 미디어를 흡인하고 갓 만든 MMC 미디어로 대체하십시오. 6일 간 37°C의 세포를 배양하여 3일마다 MMC 미디어를 변경합니다.
1밀리리터의 아세트산으로 증류된 탈온수 200밀리리터에 0.2 그램의 다이렉트 레드 80 파우더를 용해하여 시리우스 레드 솔루션을 준비하십시오. 세포에서 MMC 미디어를 흡인하고 각 웰에 300 마이크로리터의 Sirius Red 용액을 추가합니다. 그런 다음 세포를 인큐베이터로 90분 동안 반품합니다.
인큐베이션 후 시리우스 레드 용액을 수돗물로 부드럽게 헹구고 접시가 밤새 건조할 수 있도록 합니다. 다음 날, 시리우스 레드를 추출하여 200 마이크로리터0.1 어금다 수산화 나트륨을 각 우물에 추가하고 5~10분 동안 접시를 흔들어 놓습니다. 추출된 얼룩의 100마이크로리터를 투명 96웰 플레이트로 옮기고 마이크로 플레이트 판독기와 함께 620나노미터에서 흡광도를 측정한다.
PBS 200 마이크로리터로 각각 잘 씻고 10 분 동안 4 섭씨에서 메탄올로 세포를 고정하십시오. 그런 다음 우물에 3 %BSA를 추가하고 실온에서 30 분 동안 접시를 배양하십시오. 차단 용액을 흡인시키고 각 웰에 항 콜라겐 1 항체의 200 마이크로 리터를 추가합니다.
접시를 90분 동안 배양합니다. 그런 다음 항체를 흡인하고 세척당 5 분 동안 PBS로 우물을 세 번 씻습니다. 염소 안티 래빗 -FITC 보조 항체 및 DAPI의 200 마이크로 리터를 각각 의 우물에 추가합니다.
알루미늄 호일로 접시를 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 이차 항체 및 DAPI를 버리고 PBS로 세차장을 반복하십시오. 그런 다음 현미경으로 직접 형광을 시각화합니다.
PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 각 우물에 40 마이크로리터의 용해 버퍼를 추가하고 파이펫 팁으로 세포 층을 긁어냅니다. 그런 다음 단백질 리세이트를 마이크로 원심분리기 튜브로 전달하여 단백질 농도를 측정합니다. 4~12%의 비스 트리스 단백질 젤에 10마이크로그램의 단백질을 적재하고 30분 동안 200볼트에서 SDS-PAGE를 수행합니다.
완료되면, 90 분 동안 90 볼트에서 서쪽 블롯을 실행하여 니트로 셀룰로오스 막으로 단백질을 전송, 젤과 멤브레인 사이의 거품 형성을 피하기 위해주의. 블로킹 버퍼의 10 밀리리터로 멤브레인을 차단합니다. 그런 다음 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1 차 항체로 배양하십시오.
다음 날, 세척당 5분간 0.1%의 TBS Tween 20으로 멤브레인을 5회 세척합니다. 그런 다음 실온에서 1 시간 동안 종에 적합한 이차 항체로 멤브레인을 배양합니다. 세싱을 반복하고 이미징 시스템으로 형광을 시각화합니다.
상용 RNA 추출 키트로 총 RNA를 정화한 후, 마이크로 부피 분광계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. 그런 다음 cDNA 합성 키트를 사용하여 첫 번째 가닥 DNA 합성을 수행합니다. CDNA를 SYBR 그린 슈퍼믹스의 10 마이크로리터와 혼합하고 샘플을 올리고뉴클레오티드 프라이머로 미리 코팅된 사용자 지정 96 웰 플레이트로 옮기습니다.
총 부피를 물과 잘 어울릴 때 20 마이크로리터로 조정하고 원고 지침에 따라 RT-PCR을 실행합니다. 비대성 흉터 유래 인간 피부 섬유아세포의 세포 밀도는 PVP 또는 대조군을 사용하는 것에 비해 Ficoll로 배양한 후 크게 증가했습니다. 피콜과 매크로 분자 혼잡 9% 분수 부피 점유율크게 다른 제형에 비해 콜라겐 하나를 포함한 콜라겐의 증착을 향상.
이것은 정량적 분석을 통해 더욱 입증되었습니다. MMC 환경에서 재배된 흉터 유래 섬유아세포 및 정상 진피 섬유아세포는 콜라겐 이외에 ECM 종의 발현을 조절하는 것으로 나타났다. 특히, 매트릭스 메탈로프로틴또는 MmPs의 높은 발현은 토착 조직에 비해 비대성 흉터 조직에 축적된 것으로 나타났다.
MMP2, 9, 13의 발현이 거시분자 혼잡 조건에서 재배된 두 세포 배양모두에서 크게 조절된 것으로 관찰되었다. MmP는 상처 치유 및 흉터 형성 중에 중요한 역할을하며 ECM 조립 및 리모델링을 조절합니다. 인터류빈 6과 혈관 내피 성장 인자의 합성은 서쪽 얼룩에서 검출할 수 없었다.
그러나 RT-PCR 분석은 인터류키닌 6의 발현이 크게 강화된 것으로 밝혀졌으며, 혈관 내피 성장 인자의 발현은 MMC 조건에서 재배된 섬유아세포에서 하향 조절되었다. 이 프로토콜을 시도할 때, 아주 몇몇 CO 병원체가 있는 진피 섬유아세포를 선택하는 것이 아주 중요합니다. 우리는 또한 아스코르브 산은 MMC 매체의 필수 성분임을 명심해야합니다.
특히 이 MMC 모델에서 콜라겐 증착 및 정렬을 더욱 감지하는 데 관심이 있습니다. 우리는 생체 내의 기본 흉터 조직과 이 것을 비교하기 위해 고급 현미경 기술을 사용할 계획입니다. 우리는 부수적인 모달 조직의 체외 진위를 향상시키기 위하여 이 매크로 분자 혼잡 기술을 사용하는 다른 사람들을 격려합니다.
물론, 거시 분자 혼잡은 또한 체외에서 질병과 병리학의 모형을 재계산하기 위하여 이용될 수 있습니다.
