我们创建了一个个体的胶原蛋白丰富的模型，以模拟细胞使用大分子挤挤技术在体内体验的环境。皮肤是一个拥挤的环境，不像我们已经用于在体外生长细胞的液体环境。与传统的单层细胞培养系统相比，该模型再现了细胞在体内经历的拥挤的分子环境，特别是在大量细胞外基质取代液态水的疤痕组织中。
除了肥大性疤痕，这种大分子挤塞技术可用于细胞外基质丰富的研究，如肺纤维化。根据手稿方向生长疤痕衍生和正常的成纤维细胞。然后将它们播种到24个井板中，每孔5万个细胞在一毫升的介质中。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板过夜。通过将菲科尔 70、菲科尔 400 和抗坏血酸混合到 10%FCS DMEM 中，准备大分子拥挤或 MMC 介质。在水浴中孵育介质，将人群分散到溶液中。
然后用0.2微米过滤器进行消毒。从成纤维细胞中吸出已花的介质，代之以新制作的 MMC 介质。在37摄氏度下孵育细胞6天，每三天更换一次MMC介质。
在200毫升蒸馏去ion化水中溶解0.2克直接红80粉末，用一毫升醋酸溶解，准备天狼星红溶液。从细胞中吸出 MMC 介质，并在每井中加入 300 微升的天狼星红溶液。然后将细胞返回孵化器90分钟。
孵育后，用自来水轻轻冲洗天狼星红溶液，让板在一夜之间风干。第二天，将200微升0.1摩尔氢氧化钠加入到每井中，并摇动盘子5至10分钟，提取天狼星红。将抽取的污渍的 100 微升转移到透明 96 井板中，并使用微板读取器测量 620 纳米的吸光度。
用200微升PBS清洗每口井，用4摄氏度的甲醇将细胞固定10分钟。然后向井中加入3%BSA，在室温下孵育板30分钟。吸气阻断溶液，并添加200微升的抗胶原蛋白一个抗体到每一个井。
孵育板90分钟。然后吸吸抗体，然后用PBS洗井三次，每次洗涤5分钟。在每个井中加入200微升山羊抗兔-FITC二级抗体和DAPI。
用铝箔盖住板，在室温下孵育30分钟。丢弃二次抗体和DAPI，用PBS重复洗涤。然后在显微镜下直接可视化荧光。
使用 PBS 洗涤细胞两次后，将 40 微升的解液缓冲液添加到每个井中，然后用移液器尖端刮擦细胞层。然后将蛋白质酸盐转移到微离心管中，以测量蛋白质浓度。将 10 微克蛋白质加载到 4 至 12% 的 Bis-Tris 蛋白凝胶的每个井中，并在 200 伏特下执行 SDS-PAGE 30 分钟。
完成后，通过运行90伏特的西印90分钟，将蛋白质转移到硝基纤维素膜上，注意避免凝胶和膜之间的气泡形成。用 10 毫升的阻滞缓冲液阻断膜。然后在四摄氏度下孵育原抗体过夜。
第二天，用0.1%的TBS Tween 20洗五次膜，每次洗涤5分钟。然后在室温下用适合物种的二级抗体孵育膜一小时。使用成像系统重复洗涤并可视化荧光。
使用商用RNA提取试剂盒纯化总RNA后，使用微体积分光光度计测量RNA浓度。然后使用cDNA合成试剂盒进行第一链DNA合成。将cDNA与10微升的SYBR绿色超级混合混合，将样品转移到定制96井板预涂的寡核苷酸底剂。
将总体积调整为每井 20 微升水，并根据手稿指示运行 RT-PCR。与使用 PVP 或对照组相比，使用 Ficoll 培养后，肥大疤痕衍生的人类皮肤成纤维细胞的细胞密度显著增加。与其他配方相比，与Fifiol的巨量拥挤在9%的分量占用率显著地增加了胶原蛋白的沉积，包括胶原蛋白一。
定量分析进一步证明了这一点。发现在MMC环境中培养的疤痕衍生成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞，除了胶原蛋白外，还调节ECM物种的表达。值得注意的是，与本地组织相比，基质金属蛋白蛋白或MMP的升高表达在肥大疤痕组织中积累。
据观察，MMP2、9和13的表达在大分子拥挤条件下培养的两种细胞培养中均明显上调节。MMP在伤口愈合和疤痕形成、调节 ECM 装配和改造过程中发挥重要作用。白细胞间六和血管内皮生长因子的合成在西方的印迹中是检测不到的。
但RT-PCR分析表明，白细胞间六的表达明显上调节，而血管内皮生长因子的表达在MMC条件下培养的成纤维细胞中则受到低调节。在尝试此协议时，选择很少使用 CO 病原体的皮质成纤维细胞非常重要。我们还必须记住，抗坏血酸是MMC介质中的基本成分。
我们特别感兴趣的是进一步检测该 MMC 模型中的胶原蛋白沉积和对齐方式。我们计划使用先进的微观技术来比较这种体外模型与体内的原生疤痕组织。我们鼓励其他人使用这种大分子挤占技术，以提高辅助模态组织的体外真实性。
当然，大分子拥挤也可以用来重新计算体外疾病和病理学的模型。
