Мы создали индивидуальную модель, богатую коллагеном, чтобы имитировать окружающую среду, которую клетки испытывают in vivo, используя макромолекулярную технику скучения. Кожа является переполненной среде, в отличие от жидкой среды, что мы уже используем для выращивания клеток в пробирке. По сравнению с традиционной системой культуры монослойных клеток, эта модель воссоздает переполненную молекулярную среду, которую клетки испытывают in vivo, особенно в рубцовых тканях, где обильная внеклеточная матрица вытесняет жидкую воду.
Помимо гипертрофических рубцов, этот макромолекулярный метод скученности может быть использован для исследований, где внеклеточная матрица в изобилии, таких как легочный фиброз. Выращиваем шрамы и нормальные фибробласты в соответствии с рукописными указаниями. Затем семя их в 24 хорошо пластин на 50000 клеток на колодец в один миллилитр среды.
Инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Подготовка макромолекулярной скученности или MMC средств массовой информации путем смешивания Ficoll 70, Ficoll 400 и аскорбиновой кислоты в 10%FCS DMEM. Инкубировать средства массовой информации в водяной бане, чтобы разогнать скученников в раствор.
Затем стерилизовать его с помощью фильтра 0,2 микрометра. Аспирировать оттраченные средства массовой информации из фибробластов и заменить его на свежеприготовленные средства массовой информации MMC. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение шести дней, меняя средства массовой информации MMC каждые три дня.
Приготовьте раствор Sirius Red, растворив 0,2 грамма порошка Direct Red 80 в 200 миллилитров дистиллированной деионизированной воды с одним миллилитром уксусной кислоты. Оспирировать средства MMC из ячеек и добавить 300 микролитров раствора Sirius Red к каждой хорошо. Затем верните клетки в инкубатор на 90 минут.
После инкубации аккуратно промойте раствор Sirius Red водопроводной водой и дайте пластине высохнуть на ночь. На следующий день извлечения Сириус Красный, добавив 200 микролитров 0,1 молярного гидроксида натрия в каждой хорошо и встряхивая пластины в течение пяти-десяти минут. Передача 100 микролитров извлеченного пятна в прозрачную пластину 96 хорошо и измерить поглощение на 620 нанометров с микро пластины читателя.
Вымойте каждый колодец с 200 микролитров PBS и исправить клетки с метанолом при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Затем добавьте 3%BSA в скважины и инкубировать пластину в течение 30 минут при комнатной температуре. Аспирировать блокирующий раствор и добавить 200 микролитров анти-коллагена по одному антителу к каждой хорошо.
Инкубировать тарелку в течение 90 минут. Затем аспирировать антитела и мыть колодцы три раза с PBS в течение пяти минут за стирку. Добавьте 200 микролитров козьего анти-Кролика-FITC вторичного антитела и DAPI к каждой хорошо.
Накройте тарелку алюминиевой фольгой и инкубировать ее в течение 30 минут при комнатной температуре. Откажитесь от вторичных антител и DAPI и повторите моет с PBS. Затем визуализируете флуоресценцию прямо под микроскопом.
После мытья клеток дважды с PBS, добавить 40 микролитров лиза буфера в каждой хорошо и соскребать клеточный слой с кончиком пипетки. Затем перенесите лизат белка в трубки микро центрифуги для измерения концентрации белка. Загрузите 10 микрограммов белка в каждый колодец из белка 4-12%Bis-Tris и выполните SDS-PAGE на 200 вольт в течение 30 минут.
После завершения, передача белка в мембрану нитроцеллюлозы, запуская западную помарку на 90 вольт в течение 90 минут, заботясь, чтобы избежать образования пузыря между гелем и мембраной. Заблокировой мембрану 10 миллилитров блокирующего буфера. Затем инкубировать его с первичными антителами при четырех градусах по Цельсию в одночасье.
На следующий день, мыть мембрану пять раз с 0,1 процента TBS Tween 20 в течение пяти минут за стирку. Затем инкубировать мембрану с видом соответствующих вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре. Повторите мойки и визуализировать флуоресценцию с помощью системы визуализации.
Очищая общую РНК коммерческим набором для экстракции РНК, измерьте концентрацию РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра. Затем используйте комплект синтеза cDNA для выполнения первого синтеза ДНК нити. Смешайте cDNA с 10 микролитров SYBR Green Supermix и передать образцы на обычай 96 хорошо пластины предварительно покрыты олигонуклеотид грунтовки.
Отрегулируйте общий объем до 20 микролитров на колодец с водой и запустите RT-PCR в соответствии с рукописными указаниями. Плотность клеток гипертрофических рубцов человеческих фибробластов кожи человека значительно увеличилась после культивирования с Ficoll по сравнению с использованием PVP или контроля. Макромолекулярная скученности с Ficoll на 9% дробного объема занятости значительно увеличилось осаждение коллагена, в том числе коллагена один, по сравнению с другими формулировками.
Это было дополнительно продемонстрировано с помощью количественного анализа. Были найдены фибробласты, полученные из шрамов, и нормальные кожные фибробласты, культивируемые в средах MMC, чтобы регулировать экспрессию видов ECM в дополнение к коллагену. Примечательно, что повышенное выражение матричных металлопротеиназ или ПМВ накапливается в гипертрофических рубцовых тканях по сравнению с местными тканями.
Было отмечено, что выражение MMP2, 9 и 13 были значительно up-regulated в обеих культурах клетки культивируемых в макромолекулярных условиях скученсти. MMPs играют важную роль во время заживления ран и образования рубцов, регулируя сборку и реконструкцию ECM. Синтез интерлеукина шести и сосудистого эндотелиального фактора роста был необнаружим в западной помарке.
Но анализ RT-PCR показал, что экспрессия интерлеукиновой шестерки была значительно выше регулируется, в то время как экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста была вниз регулируется в фибробластах, культивируемых в условиях MMC. При попытке этого протокола, это очень важно, чтобы выбрать кожные фибробласты, которые имеют очень мало патогенов CO. Мы также должны иметь в виду, что аскорбиновая кислота является важным ингредиентом в среде MMC.
Мы особенно заинтересованы в дальнейшем обнаружении осаждения коллагена и выравнивания в этой модели MMC. Мы планируем использовать передовые микроскопические методы, чтобы сравнить эту модель in vitro с родными рубцовых тканей in vivo. Мы призываем других использовать этот макромолекулярный метод скученности для улучшения подлинности вспомогательной модальной ткани in vitro.
Конечно, макромолекулярное скучение также может быть использовано для пересчета моделей заболеваний и патологий in vitro.
