Criamos um modelo individualmente rico em colágeno para imitar o ambiente que as células experimentam in vivo usando a técnica de aglomeração macromolecular. A pele é um ambiente lotado, ao contrário do ambiente líquido que já usamos para cultivar células in vitro. Comparado ao sistema tradicional de cultura celular monocamada, este modelo recria o ambiente molecular lotado que as células experimentam in vivo, especialmente em tecidos cicatricias onde a abundante matriz extracelular desloca a água líquida.
Além das cicatrizes hipertróficas, essa técnica de aglomeração macromolecular pode ser usada para estudos onde a matriz extracelular é abundante, como a fibrose pulmonar. Cresça fibroblastos derivados da cicatriz e normais de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, semeá-los em 24 placas de poço a 50.000 células por poço em um mililitro de médio.
Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Prepare a aglomeração macromolecular ou a mídia MMC misturando Ficoll 70, Ficoll 400 e ácido ascórbico em DMEM 10% FCS. Incubar a mídia em um banho de água para dispersar os crowders na solução.
Em seguida, esterilize-o com um filtro de 0,2 micrômetro. Aspire a mídia gasta dos fibroblastos e substitua-a por mídia MMC recém-feita. Incubar as células a 37 graus Celsius durante seis dias, mudando a mídia MMC a cada três dias.
Prepare uma solução Sirius Red dissolvendo 0,2 gramas de pó Direct Red 80 em 200 mililitros de água destilada desomada com um mililitro de ácido acético. Aspire a mídia MMC das células e adicione 300 microliters de solução Sirius Red a cada poço. Em seguida, devolva as células à incubadora por 90 minutos.
Após a incubação, enxágue suavemente a solução Sirius Red com água da torneira e deixe a placa secar durante a noite. No dia seguinte, extraia o Vermelho Sirius adicionando 200 microlitadores de 0,1 hidróxido de sódio molar em cada poço e sacudindo a placa por cinco a 10 minutos. Transfira 100 microliters da mancha extraída em uma placa transparente de 96 poços e meça a absorvância em 620 nanômetros com um leitor de micro placas.
Lave cada poço com 200 microliters de PBS e fixe as células com metanol a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione 3%BSA aos poços e incubar a placa por 30 minutos em temperatura ambiente. Aspire a solução de bloqueio e adicione 200 microliters de anti-colágeno um anticorpo a cada poço.
Incubar a placa por 90 minutos. Em seguida, aspire o anticorpo e lave os poços três vezes com PBS por cinco minutos por lavagem. Adicione 200 microliters de anticorpo secundário anti-coelho-fitc de cabra e DAPI a cada poço.
Cubra a placa com papel alumínio e incuba-a por 30 minutos em temperatura ambiente. Descarte o anticorpo secundário e o DAPI e repita as lavagens com PBS. Em seguida, visualize a fluorescência diretamente sob um microscópio.
Depois de lavar as células duas vezes com PBS, adicione 40 microliters de tampão de lise em cada poço e raspe a camada celular com uma ponta de pipeta. Em seguida, transfira o lise de proteína em tubos de micro centrífugas para medir a concentração proteica. Carregue 10 microgramas de proteína em cada poço de um gel de proteína Bis-Tris de quatro a 12% e execute SDS-PAGE a 200 volts por 30 minutos.
Quando terminar, transfira a proteína para uma membrana de nitrocelulose, executando uma mancha ocidental a 90 volts por 90 minutos, tomando o cuidado de evitar a formação de bolhas entre o gel e a membrana. Bloqueie a membrana com 10 mililitros de tampão de bloqueio. Em seguida, incuba-lo com anticorpos primários a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, lave a membrana cinco vezes com 0,1% TBS Tween 20 por cinco minutos por lavagem. Em seguida, incubar a membrana com um anticorpo secundário apropriado para uma espécie por uma hora à temperatura ambiente. Repita as lavagens e visualize a fluorescência com um sistema de imagem.
Depois de purificar o RNA total com um kit comercial de extração de RNA, meça a concentração de RNA usando um espectrômetro de micro volume. Em seguida, use um kit de síntese cDNA para realizar uma síntese de DNA de primeira linha. Misture o cDNA com 10 microlitros do SYBR Green Supermix e transfira as amostras para uma placa personalizada de 96 poços pré-revestida com primers oligonucleotídeos.
Ajuste o volume total para 20 microliters por poço com água e execute RT-PCR de acordo com as instruções do manuscrito. A densidade celular de fibroblastos de pele humana derivados da cicatriz hipertrófica aumentou significativamente após a cultura com Ficoll em comparação com o uso de PVP ou o controle. A aglomeração macromolecular com Ficoll a 9% de ocupação de volume fracionado aumentou significativamente a deposição de colágeno, incluindo colágeno um, em comparação com outras formulações.
Isso foi demonstrado ainda com a análise quantitativa. Fibroblastos derivados da cicatriz e fibroblastos dérmicos normais cultivados em ambientes MMC foram encontrados para regular a expressão de espécies de ECM, além do colágeno. Notavelmente, uma expressão elevada de metaloproteínas matricial ou MMPs foi encontrada para se acumular em tecidos cicatricicos hipertróficos em comparação com tecidos nativos.
Observou-se que a expressão de MMP2, nove e 13 foram significativamente reguladas em ambas as culturas celulares cultivadas em condições de aglomeração macromolecular. Os MMPs desempenham um papel importante durante a cicatrização da ferida e da formação de cicatrizes, regulando a montagem e a remodelação do ECM. A síntese de interleucina seis e fator de crescimento endotelial vascular foi indetectável em uma mancha ocidental.
Mas a análise do RT-PCR revelou que a expressão da interleucina seis foi significativamente regulada, enquanto a expressão do fator de crescimento endotelial vascular foi regulada em fibroblastos cultivados em condições de MMC. Ao tentar este protocolo, é muito importante escolher fibroblastos dérmicos que tenham muito poucos patógenos de CO. Também temos que ter em mente que o ácido ascórbico é um ingrediente essencial no meio MMC.
Estamos particularmente interessados em detectar ainda mais a deposição e alinhamento do colágeno neste modelo MMC. Planejamos usar técnicas microscópicas avançadas para comparar este modelo in vitro com tecidos de cicatriz nativos in vivo. Encorajamos outros a usar essa técnica de aglomeração macromolecular para melhorar a autenticidade in vitro dos tecidos modais auxiliares.
É claro que a aglomeração macromolecular também pode ser usada para recalcular modelos de doenças e patologia in vitro.
