Wir haben ein individuelles Collagen-reiches Modell entwickelt, um die Umgebung zu imitieren, die Zellen in vivo mit der makromolekularen Crowding-Technik erleben. Haut ist eine überfüllte Umgebung, im Gegensatz zu der flüssigen Umgebung, die wir bereits verwenden, um Zellen in vitro zu züchten. Im Vergleich zum traditionellen monolayern Zellkultursystem stellt dieses Modell die überfüllte molekulare Umgebung wieder her, die Zellen in vivo erleben, insbesondere in Narbengeweben, wo reichlich extrazelluläre Matrix flüssiges Wasser verdrängt.
Neben hypertrophen Narben kann diese makromolekulare Crowding-Technik für Studien verwendet werden, bei denen die extrazelluläre Matrix reichlich vorhanden ist, wie lungenfibrose. Wachsen Sie Narben abgeleitete und normale Fibroblasten nach Manuskriptrichtungen. Dann säen Sie sie in 24 Brunnenplatten bei 50.000 Zellen pro Brunnen in einem Milliliter Medium.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie makromolekulare Crowding- oder MMC-Medien vor, indem Sie Ficoll 70, Ficoll 400 und Ascorbinsäure in 10%FCS DMEM mischen. Inkubieren Sie die Medien in einem Wasserbad, um die Gedränge in die Lösung zu zerstreuen.
Dann sterilisieren Sie es mit einem 0,2 Mikrometer-Filter. Die verbrauchten Medien von den Fibroblasten abscheine und durch frisch hergestellte MMC-Medien ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für sechs Tage, und wechseln Sie alle drei Tage die MMC-Medien.
Bereiten Sie eine Sirius Red Lösung vor, indem Sie 0,2 Gramm Direct Red 80 Pulver in 200 Milliliter destilliertem deionisiertem Wasser mit einem Milliliter Essigsäure auflösen. Aspirieren Sie die MMC-Medien aus den Zellen und fügen Sie 300 Mikroliter Sirius Red Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Dann geben Sie die Zellen für 90 Minuten in den Inkubator zurück.
Nach der Inkubation die Sirius Red Lösung vorsichtig mit Leitungswasser abspülen und die Platte über Nacht trocknen lassen. Am nächsten Tag extrahieren Sie den Sirius Red, indem Sie 200 Mikroliter 0,1 Mol-Natriumhydroxid in jeden Brunnen geben und die Platte fünf bis zehn Minuten schütteln. Übertragen Sie 100 Mikroliter des extrahierten Flecks in eine transparente 96-Wellplatte und messen Sie die Absorption bei 620 Nanometern mit einem Mikroplattenleser.
Waschen Sie jeden Brunnen mit 200 Mikroliter PBS und fixieren Sie die Zellen mit Methanol bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann fügen Sie 3%BSA zu den Brunnen und inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Blockierlösung und fügen Sie 200 Mikroliter Antikollagen einen Antikörper zu jedem Brunnen hinzu.
Inkubieren Sie die Platte für 90 Minuten. Dann den Antikörper absaugen Und die Brunnen dreimal mit PBS für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Fügen Sie 200 Mikroliter Ziegen-Anti-Rabbit-FITC Sekundärantikörper und DAPI zu jedem Brunnen hinzu.
Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den sekundären Antikörper und DAPI, und wiederholen Sie die Wähfe mit PBS. Dann visualisieren Sie die Fluoreszenz direkt unter dem Mikroskop.
Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie 40 Mikroliter Lysepuffer in jeden Brunnen ein und kratzen Sie die Zellschicht mit einer Pipettenspitze. Dann übertragen Sie das Proteinlysat in Mikrozentrifugenröhrchen, um die Proteinkonzentration zu messen. 10 Mikrogramm Protein in jeden Brunnen eines vier bis zwölf Prozent bis-Tris-Proteingels laden und 30 Minuten lang SDS-PAGE bei 200 Volt ausführen.
Übertragen Sie das Protein nach Fertigstellung auf eine Nitrocellulosemembran, indem Sie 90 Minuten lang einen westlichen Blot bei 90 Volt laufen lassen, wobei Darauf geachtet wird, blasenbildung zwischen Gel und Membran zu vermeiden. Blockieren Sie die Membran mit 10 Milliliter Blockierpuffer. Dann inkubieren Sie es mit primären Antikörpern bei vier Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Tag die Membran fünfmal mit 0,1 Prozent TBS Tween 20 für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Dann die Membran mit einem artgerechten Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie die Wässer und visualisieren Sie die Fluoreszenz mit einem Bildgebungssystem.
Nach der Reinigung der gesamten RNA mit einem kommerziellen RNA-Extraktionskit messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer. Verwenden Sie dann ein cDNA-Synthese-Kit, um eine erste Strang-DNA-Synthese durchzuführen. Mischen Sie die cDNA mit 10 Mikroliter SYBR Green Supermix und übertragen Sie die Proben auf eine benutzerdefinierte 96 Well Platte, die mit Oligonukleotid-Primern vorbeschichtet ist.
Stellen Sie das Gesamtvolumen auf 20 Mikroliter pro Brunnen mit Wasser ein und führen Sie RT-PCR nach Manuskriptanweisungen aus. Die Zelldichte von hypertrophen Narben-abgeleiteten menschlichen Haut-Fibroblasten erhöhte sich nach der Kultivierung mit Ficoll signifikant im Vergleich zur Verwendung von PVP oder der Kontrolle. Makromolekulare Überfüllung mit Ficoll bei 9%Fraktionsvolumenbelegung verbesserte die Ablagerung von Kollagen, einschließlich Kollagen, im Vergleich zu anderen Formulierungen signifikant.
Dies wurde durch quantitative Analysen weiter demonstriert. Narben-abgeleitete Fibroblasten und normale dermale Fibroblasten, die in MMC-Umgebungen angebaut werden, regulierten zusätzlich zu Kollagen auch die Expression von ECM-Arten. Insbesondere wurde eine erhöhte Expression von Matrix-Metalloproteinasen oder MMPs gefunden, die sich in hypertrophen Narbengeweben im Vergleich zu nativen Geweben ansammelten.
Es wurde beobachtet, dass die Expression von MMP2, neun und 13 in beiden Zellkulturen, die in makromolekularen Gedränge kultiviert wurden, signifikant hochreguliert war. MMPs spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und Narbenbildung, die Regulierung der ECM-Montage und des Umbaus. Die Synthese von Interleukin sechs und vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor war nicht nachweisbar in einem westlichen Blot.
Aber RT-PCR-Analyse ergab, dass die Expression von Interleukin sechs war deutlich up-reguliert, während die Expression der vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor war down-reguliert in Fibroblasten in MMC Bedingungen kultiviert. Beim Versuch dieses Protokolls ist es sehr wichtig, dermale Fibroblasten zu wählen, die nur sehr wenige CO-Erreger haben. Wir müssen auch bedenken, dass Ascorbinsäure ein wesentlicher Bestandteil im MMC-Medium ist.
Wir sind besonders daran interessiert, die Kollagenablagerung und -ausrichtung in diesem MMC-Modell weiter zu erkennen. Wir planen, fortschrittliche mikroskopische Techniken zu verwenden, um dieses In-vitro-Modell mit nativen Narbengeweben in vivo zu vergleichen. Wir ermutigen andere, diese makromolekulare Crowding-Technik zu verwenden, um die In-vitro-Authentizität der Hilfs-Modalgewebe zu verbessern.
Natürlich kann makromolekulare Verdrängung auch verwendet werden, um Modelle von Krankheit und Pathologie in vitro neu zu berechnen.
