יצרנו מודל אינדיבידואלי עשיר בקולגן כדי לחקות את הסביבה שתאים חווים ב-vivo באמצעות טכניקת הצפיפות המקרומולקולרית. העור הוא סביבה צפופה, בניגוד לסביבה הנוזלית שאנחנו כבר משתמשים בה כדי לגדל תאים במבחנה. בהשוואה למערכת התרבות המסורתית של תאי המונוליאר, מודל זה משחזר את הסביבה המולקולרית הצפופה שתאים חווים ב-vivo, במיוחד ברקמות צלקת שבהן מטריצה חוץ-תאית שופעת מעיף מים נוזליים.
מלבד צלקות היפרטרופיות, טכניקת צפיפות מקרומולקולרית זו יכולה לשמש למחקרים שבהם המטריצה החוץ-תאית שופעת, כגון פיברוזיס ריאתי. לגדל פיברובלסטים שמקורם בצלקות ונורמליים בהתאם לכיווני כתב היד. ואז לזרוע אותם לתוך 24 צלחות גם ב 50, 000 תאים לגם במיליליטר אחד של מדיום.
דגירה צלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. הכן צפיפות מקרומולקולרית או מדיה MMC על ידי ערבוב Ficoll 70, Ficoll 400 וחומצה אסקורבית לתוך 10%FCS DMEM. דגירה התקשורת באמבט מים כדי לפזר את ההמונים לתוך הפתרון.
לאחר מכן לעקר אותו עם מסנן מיקרומטר 0.2. שאף את התקשורת שהוצאה מהפיברובלסטים והחלף אותה במדיה MMC טרי. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שישה ימים, שינוי התקשורת MMC כל שלושה ימים.
הכן פתרון סיריוס אדום על ידי המסת 0.2 גרם של אבקת ישיר אדום 80 ב 200 מיליליטר של מים מזוקקים deionized עם מיליליטר אחד של חומצה אצטית. שאפו את מדיית MMC מהתאים והוסיפו 300 מיקרוליטרים של פתרון סיריוס רד לכל באר. ואז להחזיר את התאים לאנקובטור במשך 90 דקות.
לאחר הדגירה, יש לשטוף בעדינות את התסנובה של סיריוס רד במי ברז ולאפשר לצלחת להתייבש באוויר במשך הלילה. ביום שלמחר, לחלץ את סיריוס אדום על ידי הוספת 200 microliters של 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחנת לתוך כל באר לנער את הצלחת במשך חמש עד 10 דקות. מעבירים 100 מיקרוליטרים של הכתם המופק לצלחת שקופה של 96 באר ומודדים את הספיגה ב-620 ננומטר עם קורא לוחות מיקרו.
לשטוף כל באר עם 200 microliters של PBS ולתקן את התאים עם מתנול בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו 3%BSA ל הבאר והו דגירה של הצלחת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את פתרון החסימה והוסיפו 200 מיקרוליטרים של נוגדן אחד נגד קולגן לכל באר.
להתהגר בצלחת במשך 90 דקות. ואז לשוטוף את הנוגדן ולשטוף את בארות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. הוסף 200 מיקרוליטרים של נוגדן משני נגד ארנב-FITC עזים ו- DAPI לכל באר.
מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדרגים אותה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את הנוגדן המשני ואת DAPI וחזור על השטיפה עם PBS. ואז לדמיין את הפלואורסצנטיות ישירות תחת מיקרוסקופ.
לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBS, מוסיפים 40 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לתוך כל באר ומגרדים את שכבת התא עם קצה פיפטה. לאחר מכן מעבירים את החלבון ליאזט לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגה כדי למדוד את ריכוז החלבון. טוענים 10 מיקרוגרם חלבון לתוך כל באר של ג'ל חלבון ביס-טריס של 4 עד 12% ומבצעים SDS-PAGE ב-200 וולט למשך 30 דקות.
כאשר סיים, להעביר את החלבון קרום nitrocellulose על ידי הפעלת כתם מערבי ב 90 וולט במשך 90 דקות, דואג למנוע היווצרות בועה בין הג'ל לבין הממברנה. חסום את הממברנה עם 10 מיליליטר של חיץ חסימה. ואז לה הדגירה אותו עם נוגדנים ראשוניים בארבע מעלות צלזיוס לילה.
ביום שלמחר, לשטוף את הממברנה חמש פעמים עם 0.1 אחוז TBS Tween 20 במשך חמש דקות לשטוף. לאחר מכן הדגירה את הממברנה עם נוגדן משני מתאים למינים במשך שעה בטמפרטורת החדר. חזור על השטיפה והדמיה פלואורסצנטיות עם מערכת הדמיה.
לאחר טיהור RNA הכולל עם ערכת מיצוי RNA מסחרית, למדוד ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו נפח. לאחר מכן השתמש בערכת סינתזה cDNA כדי לבצע סינתזת DNA גדיל הראשון. מערבבים את cDNA עם 10 microliters של SYBR ירוק Supermix ולהעביר את הדגימות מותאם אישית 96 צלחת גם מצופה מראש עם פריימרים oligonucleotide.
כוונן את הנפח הכולל ל-20 מיקרוליטרים ל באר עם מים והפעל את RT-PCR בהתאם לכיווני כתב היד. צפיפות התאים של פיברובלסטים של עור אנושי המופק מצלקת היפרטרופית גדלה באופן משמעותי לאחר culturing עם Ficoll בהשוואה לשימוש PVP או הפקד. צפיפות מקרומולקולרית עם Ficoll ב-9% נפח חלקי שיפרה באופן משמעותי את התצהיר של קולגן, כולל קולגן אחד, בהשוואה לנוסחים אחרים.
זה הודגם עוד יותר עם ניתוח כמותי. פיברובלסטים שמקורם בצלקות ופיברובלסטים עוריים רגילים שטופחו בסביבות MMC נמצאו כדי לווסת את הביטוי של מיני ECM בנוסף קולגן. יש לציין, ביטוי גבוה של מטריקס metalloproteinases או MMPs נמצאה לצבור ברקמות צלקת היפרטרופית לעומת רקמות מקומיות.
זה נצפתה כי הביטוי של MMP2, תשעה ו -13 היו מוסדר באופן משמעותי בשני תרבויות התא מעובד בתנאי צפיפות מקרומולקולרית. MMPs ממלאים תפקיד חשוב במהלך ריפוי פצעים היווצרות צלקת, ויסות הרכבה ECM ושיפוץ. סינתזה של interleukin שש וגורם גדילה אנדותל כלי הדם היה בלתי ניתן לגילוי כתם מערבי.
אבל ניתוח RT-PCR גילה כי הביטוי של interleukin שש היה מוסדר באופן משמעותי, בעוד הביטוי של גורם הגדילה אנדותל כלי הדם היה מוסדר למטה פיברובלסטים מעובדים בתנאי MMC. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב מאוד לבחור פיברובלסטים עוריים שיש להם מעט מאוד פתוגנים CO. אנחנו גם צריכים לזכור כי חומצה אסקורבית היא מרכיב חיוני במדיום MMC.
אנו מעוניינים במיוחד בזיהוי נוסף של תצהיר הקולגן והיישור במודל MMC זה. אנו מתכננים להשתמש בטכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות כדי להשוות את המודל הזה במבחנה עם רקמות צלקת מקומיות ב vivo. אנו מעודדים אחרים להשתמש בטכניקת צפיפות מקרומולקולרית זו כדי לשפר את האותנטיות במבחנה של הרקמות המודאליות.
כמובן, צפיפות מקרומולקולרית יכולה לשמש גם לחישוב מחדש של מודלים של מחלות ופתולוגיה במבחנה.
