Bu protokol, mevcut mikrobiyal maddelerin ve çevresel alerjenlerin alerjik inflamasyon gelişimini nasıl düzenleyebileceği konusunda çok önemli ve çözülmemiş bir sorunu ele almak üzere tasarlanmıştır. Özellikle, burada sunulan yöntemler ev tozu akarları çift iplikli RNA türlerinin in vivo immünojenik olup olmadığını ve eozinofilik akciğer iltihabı modüle mümkün olup olmadığını cevap yardımcı olabilir. Bu tekniklerin başlıca avantajları basit, verimli, yüksek oranda tekrarlanabilir olmaları ve yaygın olarak kullanılan araç ve gereçler kullanılarak yapIlebilmektedir.
Bu yöntemler solunum yolu viral enfeksiyonların neden olduğu akciğer hastalıklarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Li She, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi, prosedürü göstermeye yardımcı olacak. Toplam RNA'yı alerjenlerden, böceklerden ve böcek dışı alerjenlerden izole ederek başlayın.
Uygun miktarda numuneyi 1,4 milimetre seramik boncuk içeren iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpleri sıvı nitrojen kabındaki tüpleri yaklaşık 10 dakika dondurun. Her tüpe bir mililitre guanidinium tiyosiyanat bazlı RNA izolasyon reaktifi ekleyin. Sonra 45 saniye boyunca maksimum hızda yüksek enerjili hücre bozucu ile böcek ve böcek olmayan küçük hayvanlar kırın.
Numuneyi buzüzerinde soğutun ve bu işlemi iki kez tekrarlayın. Çözeltiyi 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Her tüpe 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve numuneyi girdaplayın.
Tüpleri 14,000 kez 4 santigrat derecede 14 dakika santrifüj edin. Daha sonra üst sulu fazı 500 mikrolitre izopropanol içeren yeni bir tüpe aktarın. Örneği karıştırın.
Sonra 14, 000 kez g 14 dakika 4 santigrat derece santrifüj. Supernatant'ı dikkatlice aspire edin. Daha sonra RNA peletini 500 mikrolitre %75 etanol ile yıkayın ve 7,500 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Tüm sıvıyı dikkatlice çıkarın. Pelet hava kurutun ve RNA'yı 20 ila 50 mikrolitre RNase içermeyen suyla eritin. Toplam RNA'daki çift iplikli RNA yapılarını tespit etmek için, 200 nanogramlık mikrolitre başına mikrolitre RNA örneğini pozitif yüklü naylon membranüzerine noktalandırın.
1, 200 microjoule 100 bir UV crosslinker örnekleri çapraz bağlantı. Lekeleme ve iki kez daha çapraz bağlama tekrarlayın, bu da leke başına toplam 1,2 mikrogram RNA ile sonuçlanır. Oda sıcaklığında sallayarak bir saat boyunca TBS-T%5 süt ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin.
Daha sonra blokaj çözeltisini çıkarın ve TBS-T'de %1 sütte bire bir, 000 seyreltme de çift iplikçikli RNA J2 antikorekleyin. Membranı bir gecede dört santigrat derecede sallayarak kuluçkaya yatırın. Ertesi gün membranı tbs-T ile üç kez yıkayın ve yıkama başına beş dakika yıkayın.
İkincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca membran kuluçka. Sonra TBS-T ile yıkıntıları tekrarlayın. Substrat ekleyin ve istenilen sinyal görünür olana kadar 5 ila 15 dakika boyunca membran kuluçka.
Membranı çift distile suyla durulayarak reaksiyonu durdurun. Akciğer örneklerini toplamak için, doku kağıtları üzerine akciğerler ilerler ve her akciğer lobu küçük bir parça çıkarmak. Her parçayı boncuk içeren iki mililitrelik bir tüpiçine yerleştirin.
Bronkoalveoler lavaj toplamak için,% 70 etanol ile bir ötenazi fare dezenfekte, ve boyun karın üst bölgesinden deri kesmek için makas kullanın. Yavaşça tükürük bezleri ve sternohyoid kas ayrı trakea ortaya çıkarmak için forceps ile çekin. Sonra altına bir naylon dize yerleştirin.
Gırtlak altında yaklaşık iki mililitre trakea bir kesi yapmak sadece bir kanül eklemek için yeterli, ve trakea ve kanül etrafında dize düğüm. Kanülün ucuna bir şırınga takın ve taze PBS-EDTA ile yükleyin. Sonra enjekte ve akciğeriçine çözeltinin bir mililitre aspire.
Şırıngayı kanülden ayırın ve çözeltiyi 15 mililitrelik bir tüpe atın. Taze PBS-EDTA ile buz bu işlemi tekrarlayın ve lavaj havuz. Tüpü 500 kez g'de dört santigrat derecede yedi dakika santrifüj edin.
Sonra hacmi kaydedin ve pelet rahatsız etmeden iki 1.5 mililitrelik tüpler için supernatant aktarın. Pelet imal edildikten sonra, 150 mikrolitreyi 96 kuyulu bir plakaya aktarın ve plakayı 500 kez g ve 4 santigrat derecede yedi dakika santrifüj edin. Sonra hızlı bir şekilde supernatant kaldırmak için kağıt mendil üzerinde plaka ters.
2.4G2 bloke antikor varlığında FACS tampon antikorları ile hücreleri leke ve karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka kuluçka. Boyama sonra, dört santigrat derece yedi dakika boyunca 500 kez g hücreleri pelet için plaka santrifüj. Kağıt mendil üzerinde plaka ters çevirerek boyama çözeltisi çıkarın.
Hücreleri yıkamak için 100 mikrolitre FACS arabelleği ekleyin ve sonra santrifüjü tekrarlayın. 150 mikrolitre FACS tamponundaki numuneleri yeniden askıya alın ve 350 mikrolitre ek tampon içeren FACS tüplerine aktarın. Her numuneye 25 mikrolitre sayma boncuk ekleyin ve akış sitometri analizine devam edin.
Ev tozu akarları, böcekler ve böcek olmayan küçük hayvanlarda uzun çift iplikli RNA yapılarının varlığı çift iplikli, RNA'ya özgü fare monoklonal antikor kullanılarak nokta lekesi ile incelendi. RNase III, çift iplikli RNA'yı J2 tarafından tespit edilemeyen 12-15 baz çifti parçasına sindirmek için kullanıldı. Ev tozu akarı toplam RNA fare akciğerlerinde doğuştan gelen bir bağışıklık yanıtı uyarmak için yeteneği RT-qPCR tarafından gösterilmiştir. RNase III tedavisi ev tozu akarı toplam RNA immünstimülan aktivitesi ni ortadan kaldırarak, çift iplikli RNA yapılarının akciğerlerde doğuştan gelen bağışıklık aktivitesi için gerekli olduğunu belirtti.
Ev tozu akarı toplam RNA'nın şiddetli tip iki akciğer iltihabı gelişimi üzerindeki inhibitör etkisi FACS analizi ile değerlendirildi. Eozinofilik akciğer iltihabı toz akar özleri tarafından indüklenen, rnase III ile veya olmadan tedavi edildi. Uzun çift iplikli RNA türlerinin bozulması şiddetli tip iki akciğer iltihabı ile sonuçlandı, bronkoalveoler lavaj ve akciğerlerde artan eozinofil sayıları ile yansıyan.
Özellikle, toz akarı toplam RNA tedavi grubunda eozinofil sayısı endojen uzun çift iplikçikli RNA türleri içeren orijinal toz akarı ekstresi ile tedavi grup karşılaştırılabilir. Bu protokolü denerken, BAL sıvısını enjekte ederken ve geri toplarken çok dikkatli olun, çünkü bu aşamada akciğerlerde meydana gelen herhangi bir hasar nihai sonuçları değiştirebilir. Bu prosedüre ek olarak, BAL sıvısında bulunan hücresel olmayan çözünür içeriği analiz etmek için ELISA gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Bu teknik, geliştirilmesinden sonra, araştırmacıların çevresel alerjenlerde bulunan diğer mikrobiyal maddeleri keşfetmelerinin önünü açmıştır, örneğin alerjik akciğer iltihabı gelişimini düzenleyen çift iplikçikli olmayan RNA faktörleri gibi.
