Bu teknik, canlı dokudaki tek hücrelere daha yakından bakmayı mümkün kılar. Tek hücreleri izleyerek ve manipüle ederek, gelişim sırasında doku oluşumunu daha iyi anlayabiliriz. Bu yöntemin görsel gösterimi, potansiyel kullanıcıların bu tekniğin çalışmaları için yararlı olup olmadığına karar vermelerine olanak tanır.
Ayrıca, kullanıcıların uygulamanın nasıl çalıştırıldığını görmelerini mümkün kılar, bu da yalnızca metinden kavramak zor olur. Bu protokol değerlendirilebilir bir yüzeye sahip her dokuya uygulanabilir. Aynı dokularda farklı hücreleri, aynı türdeki farklı dokuları ve farklı türleri hedef alıyoruz.
Bu protokolü denerken, odaklanmış kalmak ve hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir. Diseksiyonun başlamasından önce tüm ekipmanlar hazırlanmalıdır. Otomatik enjektör yazılımı yükleyerek ve mikropipet puller ile borosilikat cam kılcal damarları gelen mikroenjeksiyon pipetler çekerek başlayın.
Pipetleri tozdan korunduğu nda üç güne kadar saklayın. Bir mikrodalga fırın kullanarak% 3 geniş menzilli agarose eritin. Agarose 37 santigrat derecede bir su banyosunda tutarak katılaşmasına izin vermeyin.
Bir scm ve sıcak 10 ila 12 mililitre SIM ve 37 santigrat derece tyrode çözeltisi 20 mililitre bir su banyosu kullanarak bir aliquot çözülme. Floresan izleyiciyi enjekte edilecek diğer kimyasallarla karıştırın, ardından mikroenjeksiyon çözeltisini 16,000 kez G'de 4 santigrat derecede 30 dakika santrifüj edin. Supernatant toplamak ve yeni bir tüp içine aktarın.
Mikroenjeksiyon çözeltisini kullanıma kadar buzüzerinde tutun. Telensefalon organotipik doku dilimleri hazırlamak için E13.5 E16.5 fare embriyoları kafaları kullanın. Deri çıkarın ve orta hat boyunca hareket eden forceps ile kafatası açın.
Açık kafatasından embriyonik beyni parçala ve beynin ventral tarafından başlayarak beyin dokusunu kaplayan menenjleri çıkarın. Tyrode'un çözeltisinde parçalanmış tüm beyni 37 santigrat derece ısıtma bloğunda bırakın. Tek kullanımlık bir katıştırma kalıbına geniş bir yelpazede erimiş agarose dökün.
38-39 santigrat dereceye kadar soğuduğunda, pasteur pipetini kullanarak agarose'a dört beyne kadar dikkatlice aktarın. Bir spatula veya dumont bir numaralı forceps bir çift doku dokunmadan doku etrafında agarose karıştırın. Agarose oda sıcaklığında katılaşmaya bırakın.
Agarose katıladıktan sonra, dokuyu çevreleyen fazlalığı kırpın. Arabellek tepsisini PBS ile doldurun. Tepsiye dik dokunun rostral kaudal ekseni ile beyin yönlendirmek ve bir vibratom kullanarak 250 mikrometre dilimleri kesti.
Önceden ısıtılmış iki mililitre ile 3,5 santimetre Petri çanak doldurun, sonra bu çanağa 10 ila 15 dilim aktarmak için plastik bir Pasteur pipet kullanın. Bittiğinde, dilimler ile Petri çanak dilim kültür kuluçka içine aktarın. Nemlendirilmiş bir atmosferde dilimleri 37 derecede koruyun.
Bilgisayarı, mikroskopu, mikroskop kamerasını, manipülatörleri, basınç teçhizatını ve basınç sensörünü açın. Dosyayı tıklatarak uygulamayı yükleyin, uygulamayı başlatın.py GitHub'dan indirilen ana klasörde başlatın ve açılan ekranda cihaz ayarlarını belirtin.
İstenmeyen tıkanmayı önlemek için pipeti çözeltiye batırmadan önce dışa doğru bir basınç oluşturun. Telafi basınç çubuğunu %24-45'e kaydırın ve değerleri ayarla'yı tıklatın. Ardından, mekanik basınç valfi tokuzunu basınç sensöründe belirtildiği gibi 1-2 PSI'ya çevirerek basıncı ayarlayın.
Dilimleri, önceden ısıtılmış sim iki mililitre içeren 3,5 santimetrelik Petri kabının merkezine aktarın, ardından Petri kabını önceden ısıtılmış mikroenjeksiyon aşamasına yerleştirin. Mikroenjeksiyon pipetini uzun uçlu plastik pipet kullanarak 1,4 ila 1,6 mikrolitre mikroenjeksiyon çözeltisi ile yükleyin ve mikroenjeksiyon pipetini pipet tutucuya takın. Mikroskoptaki en düşük büyütmeyi kullanarak, dilimi odak noktası haline getirin ve mikropipeti bu görüş alanına yönlendirin, böylece dilim hedefiyle aynı düzleme odaklanın.
FOV'u ve uygulamayı görmek için mikroskop çıktısını kameraya geçirin. Aygıt kalibrasyonını başlatmak için arabirimin sol üst kısmındaki büyütme düğmesini tıklatın. Bir pencere büyütme seçmek istediğinde, 10X'i seçin ve Tamam'a basın. Yazılım iç objektif objektif 10X olduğunu varsayar.
Mikroskobun mikrometrik tekerleği kullanarak pipet ucunu yeniden odakla ve imleçile pipet ucunu tıklatın. Ardından, adım 1.1 düğmesine basın ve açılır pencerede Tamam'a basın. Pipet y yönünde hareket edecektir.
Pipetin ucunu tıklatın ve adım 1.2 düğmesine basın. Son olarak, pipet açı kutusuna 45 girin ve set açısına basın. Otomatik mikroenjeksiyon kontrol paneline istenilen parametreleri girin ve hızı %100'e ayarlayın Bittiğinde, ayar değerlerini tıklatın.
Çizim kenarı düğmesini tıklatın ve enjeksiyon yörüngesini tanımlamak için açılır pencerede istenen yörünge boyunca imleci sürükleyin. Mikro enjekte eden nöronlar için, telensefalon bazal tarafı hedef. Pipeti çizginin başına getirin ve ucunu tıklatın, sonra mikroenjekte başlatmak için çalıştır yörüngesini tıklatın.
Hedeflenen her enjeksiyon düzlemi için bu adımı tekrarlayın. Kollajen karışımı içine dilimleri batırın, sonra 35 milimetre cam alt çanak 14 milimetrelik bir kuyu içine kollajen 200 ila 300 mikrolitre ile birlikte dilimleri aktarın. Dilimleri niçin besin ve oksijen alımı için en uygun koşul olan mümkün olan en az miktarda kollajen kaplı olduğundan emin olun.
İki çift forsep skullanarak dilimleri yönlendirin ve Kollajenin katılabilmesi için Petri kabını 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Petri kabını 40 dakika daha dilim kültür kuluçka makinesine taşıyın ve önceden ısıtılmış iki mililitre SCM ekleyin. Kültürün sonunda, dilim kültür kuluçka kesip dilimleri almak ve SCM aspire.
PBS ile kollajen gömülü dilimleri yıkayın, sonra% 4 paraformaldehit ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında doku bırakın. Bir gecede fiksasyon için dört santigrat dereceye taşıyın. Ertesi gün, paraformaldehit çözeltisi aspire ve PBS ile dilimleri yıkayın.
Bir stereo mikroskop altında iki çift forceps kullanarak kollajen gelen dilimleri çıkarın. % 3 düşük erime noktası agarose eritmek için bir mikrodalga kullanın, sonra tek kullanımlık bir katıştırma kalıp içine dökün ve yaklaşık 38 veya 39 santigrat derece soğumasını bekleyin. Bu kalıp içine doku dilimleri aktarın dilimin soyma tarafı kadar bakan olduğundan emin olmak, sonra oda sıcaklığına kadar soğumasını sağlamak ve katılaşmak için agarose sağlar.
Dilimleri çevreleyen ekstra agarose kırpın. Kesme yüzeyinin vibratomun kesme bıçağına paralel olmasını ve 50 mikrometre kalınlığında kesiştiğini sağlamak için agarose bloğunu yönlendirin. PBS ile 24 kuyulu bir çanak doldurun ve ince uçlu bir boya fırçası kullanarak bu tabağa bölümleri aktarın, sonra standart protokollere göre immünororesans gerçekleştirin.
Başarılı bir şekilde enjekte edilen ata hücrelerinin ve yenidoğan nöronların temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. Dextran Alexa 488 enjekte edildiğinde, hücreler boya ile tamamen dolu görünür. Otomatik mikroenjeksiyon manuel mikroenjeksiyon ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek iş artışı sağlayabilir.
Ayrıca, EDU etiketleme hücre canlılığı otomasyon etkilenmez onaylar. Organotipik dilimin kültürde tutulması, mikroenjekte edilen hücrelerin soy ilerlemesini izlemeyi mümkün kılar. Tek nöral kök hücrelere mikroenjeksiyon mükemmel tek hücre çözünürlüğü sağlar.
Bu nedenle, nöral kök hücre ilerlemesi ve kader geçişi hücre biyolojisi incelemek için kullanılmıştır. Bu protokol, Dextran A555 ile birlikte Lucifer sarıenjekte ederek yenidoğan nöronlarda junctional kaplin çalışması için kullanılmıştır. Yenidoğan piramidal nöronların bir kısmı, olgunlaşmamış nöronların boşluk kavşağı üzerinden iletişim kurma fikriyle tutarlı olan komşu nöronlarla boşluk kavşakları ile birleştiğinde ydi.
Bu tekniği beyin gelişimi ve beyin evriminin hücre biyolojisini araştırmak için kullandık. Nöral kök hücre davranışını etkileyen birkaç aday gen üzerinde çalıştık ve nasıl çalıştıklarını, nöral kök hücre soy ilerlemesini ve beyin gelişimi sırasında nöran üretimini nasıl etkilediğini keşfedip anlayabildik.
