이 기술은 살아있는 조직에 있는 단 하나 세포에 자세히 보는 것을 가능하게 합니다. 단일 세포를 추적하고 조작함으로써, 우리는 개발 하는 동안 조직 형성을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 방법을 시각적으로 데모하면 잠재적 사용자가 이 기술이 작업에 도움이 될 수 있는지 여부를 결정할 수 있습니다.
또한 사용자가 응용 프로그램이 실행되는 방식을 볼 수 있으므로 텍스트만 에서 파악하기가 어렵습니다. 이 프로토콜은 평가 가능한 표면을 가진 모든 조직에 적용될 수 있습니다. 우리는 동일한 조직에서 다른 세포를 대상으로 하고있다, 같은 종에 다른 조직, 또한 다른 종.
이 프로토콜을 시도할 때는 집중력을 유지하고 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 모든 장비는 해부를 시작하기 전에 준비해야 합니다. 자동 인젝터 소프트웨어를 설치하고 마이크로 피펫 풀러와 borosilicate 유리 모세 혈관에서 미세 주입 파이펫을 당겨 시작합니다.
피펫을 먼지로부터 보호하는 최대 3일 동안 보관하십시오. 전자 레인지를 사용하여 3 % 넓은 범위의 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈가 섭씨 37도의 수조에 보관하여 굳어지게 하지 마십시오.
SCM을 해동하고 10~12밀리리터 SIM과 티로데의 용액 20밀리리터를 수조를 사용하여 섭씨 37도까지 해동하십시오. 형광 추적기를 다른 화학 물질과 혼합한 다음 16, 000배 G에서 4도에서 30분 동안 미세 주입 용액을 원심분리합니다. 상체를 수집하고 새로운 튜브로 전송합니다.
사용 전까지 미세 주입 용액을 얼음에 보관하십시오. E13.5에서 E16.5 마우스 배아까지의 헤드를 사용하여 텔렌세팔론의 조직 조각을 준비합니다. 피부를 제거하고 중간선을 따라 움직이는 집게로 두개골을 엽니다.
열린 두개골에서 배아 뇌를 해부하고 뇌의 복부 측면에서 시작하는 뇌 조직을 덮는 수막을 제거합니다. 37섭씨 난방 블록에 티로드의 용액에 해부된 전체 뇌를 남겨주세요. 용융 된 아가로즈를 일회용 포함 금형에 붓습니다.
섭씨 38~39도로 식으면 파스퇴르 파이펫을 사용하여 최대 4개의 뇌를 아가로즈로 조심스럽게 옮겨 넣습니다. 주걱이나 두몬트 넘버 원 포스폰한 쌍으로 조직을 섞어 줍니다. 실온에서 아가로즈를 고성화시키십시오.
아가로즈가 고화되면 조직을 둘러싼 과잉을 다듬습니다. 버퍼 트레이를 PBS로 채웁니다. 트레이에 수직인 조직의 장밋랄 코골 축으로 뇌를 방향을 지정하고 진동을 사용하여 250 마이크로미터 슬라이스를 잘라냅니다.
3.5센티미터 페트리 접시에 미리 데워진 2밀리리터의 페트리 접시를 채운 다음 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 10~15슬라이스를 이 요리로 옮기습니다. 완료되면, 슬라이스와 페트리 접시를 슬라이스 문화 인큐베이터로 옮킨다. 가습된 분위기에서 섭씨 37도에서 슬라이스를 유지합니다.
컴퓨터, 현미경, 현미경 카메라, 조작기, 압력 장비 및 압력 센서를 켭니다. 파일을 클릭하여 응용 프로그램을 로드하고, GitHub에서 다운로드 한 기본 폴더에서 .py 앱을 실행하고 팝업 화면에서 장치 설정을 지정합니다.
원치 않는 막힘을 방지하려면 파이펫을 솔루션에 잠기전에 바깥쪽 압력을 만듭니다. 보정 압력 막대를 24~45%로 밀어 내고 설정된 값을 클릭합니다. 다음으로, 압력 센서에 의해 표시된 대로 기계압력 밸브 노브를 1~2PSI로 전환하여 압력을 조정합니다.
미리 데워진 SIM 2밀리리터가 포함된 3.5센티미터 페트리 접시의 중앙으로 슬라이스를 옮은 다음, 페트리 접시를 섭씨 37도로 예열된 미세 주입 단계에 놓습니다. 긴 팁 플라스틱 파이펫을 사용하여 마이크로 주입 용액의 1.4 ~ 1.6 마이크로 리터로 마이크로 주입 파이펫을 로드하고 파이펫 홀더에 마이크로 주입 파이펫을 삽입합니다. 현미경에서 가장 낮은 배율을 사용하여 슬라이스를 초점으로 가져와 마이크로 파이프를 이 시야로 안내하여 슬라이스 대상과 동일한 평면에 초점을 맞춥니다.
현미경의 출력을 카메라로 전환하여 FOV 및 응용 프로그램을 확인합니다. 인터페이스 왼쪽 상단의 배율 버튼을 클릭하여 장치 교정을 시작합니다. 창이 배율을 선택하라는 메시지가 표시되면 10X를 선택하고 확인을 누릅니다. 이 소프트웨어는 내부 목표 렌즈가 10배라고 가정합니다.
현미경의 미세 측정 휠을 사용하여 파이펫 팁을 다시 초점을 맞추고 커서로 파이펫 팁을 클릭합니다. 다음으로, 1.1 단계 버튼을 누르고 팝업 창에서 확인을 누릅니다. 파이펫은 y 방향으로 이동합니다.
파이펫 끝을 클릭하고 1.2 단계 버튼을 누릅니다. 마지막으로 파이펫 앵글 박스에 45를 입력하고 세트 각도를 누릅니다. 자동화된 미세 주입 제어판에 원하는 매개 변수를 입력하고 속도를 100%로 설정하면 설정된 값을 클릭합니다.
그리기 가장자리 버튼을 클릭하고 팝업 창에서 원하는 궤적을 따라 커서를 드래그하여 주입 궤적을 정의합니다. 미세 주입 뉴런의 경우, 텔렌스팔론의 기저 측을 대상으로합니다. 파이프를 선의 시작 부분에 가져와 팁을 클릭한 다음 실행 궤적을 클릭하여 마이크로 주입을 시작합니다.
대상 주입의 모든 평면에 대한이 단계를 반복합니다. 콜라겐 혼합물에 슬라이스를 담근 다음 콜라겐의 200~300마이크로리터와 함께 슬라이스를 35mm 유리 바닥 접시의 14mm 웰로 옮킨다. 슬라이스가 영양소와 산소 섭취에 가장 적합한 조건인 가능한 최소한의 콜라겐으로 덮여 있는지 확인하십시오.
두 쌍의 집게를 사용하여 슬라이스를 방향을 지정하고 콜라겐이 고화될 수 있도록 가열 블록에서 섭씨 37도에서 5분 동안 페트리 접시를 배양합니다. 페트리 접시를 슬라이스 배양 인큐베이터로 40분 더 이동한 다음 미리 데워진 SCM2밀리리터를 추가합니다. 문화가 끝나면 슬라이스 배양 인큐베이터에서 슬라이스를 꺼내 SCM을 흡인합니다.
콜라겐 에 내장 된 조각을 PBS로 씻은 다음 4 % para포름알데히드를 넣고 30 분 동안 실온에서 조직을 둡니다. 하룻밤 고정을 위해 섭씨 4도로 이동합니다. 다음 날, 파라 포름알데히드 용액을 흡인하고 PBS로 슬라이스를 씻으세요.
스테레오 현미경의 밑에 집게의 2 쌍을 사용하여 콜라겐에서 조각을 제거합니다. 전자레인지를 사용하여 3% 낮은 융점 아가로즈를 녹인 다음 일회용 임베딩 몰드에 붓고 섭씨 약 38도 또는 39도로 식힙니다. 이 금형에 티슈 슬라이스를 전달하여 슬라이스의 껍질 면이 위로 향하고 있는지 확인한 다음 아가로즈가 실온으로 식히고 고화되도록 합니다.
슬라이스를 둘러싼 여분의 아가로즈를 다듬습니다. 아가로즈 블록을 오리엔팅하여 절단 표면이 진동의 절단 블레이드와 평행하고 50 마이크로미터 두께의 단면을 절단합니다. PBS로 24웰 접시를 채우고 미세 팁 페인트 브러시를 사용하여이 접시에 섹션을 옮은 다음 표준 프로토콜에 따라 면역 형광을 수행합니다.
성공적으로 주입 된 전구 세포와 신생아 뉴런의 대표적인 이미지가 여기에 표시됩니다. Dextran Alexa 488을 주입하면 세포가 완전히 염색으로 채워진 것처럼 보입니다. 자동화된 미세 주입은 수동 미세 주입에 비해 훨씬 더 높은 처리량을 제공할 수 있습니다.
또한 EDU 라벨링은 세포 생존가능성이 자동화의 영향을 받지 않는다는 것을 확인합니다. 배양에 organotypic 조각을 유지하면 마이크로 주입 된 세포의 계보 진행을 따를 수 있습니다. 단일 신경 줄기 세포에 미세 주입은 우수한 단일 세포 해상도를 제공합니다.
따라서, 신경 줄기 세포 진행 및 운명 전환의 세포 생물학을 해부하는 데 사용되어 왔다. 이 프로토콜은 Dextran A555와 함께 루시퍼 옐로우를 주입하여 신생아 뉴런에서 접합 커플링을 연구하는 데 사용되었습니다. 신생아 피라미드 뉴런의 비율은 미숙한 뉴런이 갭 접합을 통해 통신한다는 생각과 일치하는 이웃 뉴런에 갭 접합을 통해 결합되었습니다.
우리는 두뇌 발달과 두뇌 진화의 세포 생물학을 조사하기 위하여 이 기술을 이용했습니다. 우리는 신경 줄기 세포 행동에 영향을 미치고 있던 몇몇 후보 유전자를 공부하고 우리는 그(것)들이 어떻게 작동하는지, 신경 줄기 세포 혈통 진행에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 두뇌 발달 도중 신경 생산을 발견하고 이해할 수 있었습니다.
