Essa técnica permite dar uma olhada mais de perto em células únicas em tecido vivo. Rastreando e manipulando células únicas, podemos entender melhor a formação de tecidos durante o desenvolvimento. A demonstração visual deste método permite que os usuários em potencial decidam se essa técnica pode ser útil para o seu trabalho.
Além disso, permite que os usuários vejam como o aplicativo é executado, o que seria difícil de entender apenas a partir do texto. Este protocolo pode ser aplicado a todos os tecidos com uma superfície avaliavel. Temos visado diferentes células nos mesmos tecidos, tecidos diferentes na mesma espécie, e também espécies diferentes.
Ao tentar este protocolo, é importante manter o foco e trabalhar rapidamente. Todos os equipamentos devem ser preparados antes de iniciar a dissecção. Comece instalando o software do injetor automático e puxando as pipetas de microinjeção de capilares de vidro borossilicato com o puxador de micropipette.
Armazene as pipetas por até três dias protegidas contra poeira. Derreta 3% de largura usando um forno de micro-ondas. Não deixe que a agarose solidifique mantendo-a em um banho de água a 37 graus Celsius.
Descongele uma alíquota de SCM e aqueça de 10 a 12 mililitros SIM e 20 mililitros da solução de Tyrode a 37 graus Celsius usando um banho de água. Misture o rastreador fluorescente com os outros produtos químicos a serem injetados, depois centrífugue a solução de microinjeção a 16.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Pegue o supernatante e transfira-o para um novo tubo.
Mantenha a solução de microinjeção no gelo até usar. Use as cabeças de embriões de camundongos E13.5 a E16,5 para preparar fatias de tecido organotipípico do telencephalon. Remova a pele e abra o crânio com fórceps movendo-se ao longo da linha média.
Disseca o cérebro embrionário do crânio aberto e remova as meninges que cobrem o tecido cerebral a partir do lado ventral do cérebro. Deixe o cérebro inteiro dissecado na solução de Tyrode no bloco de aquecimento de 37 graus Celsius. Despeje a ampla gama de agarose derretida em um molde de incorporação descartável.
Quando esfriar a 38 a 39 graus Celsius, transfira cuidadosamente até quatro cérebros para a agarose usando uma pipeta Pasteur. Mexa a agarose ao redor do tecido com uma espátula ou um par de fórceps dumont número um sem tocar no tecido. Deixe a agarose solidificar à temperatura ambiente.
Uma vez que a ágarose se solidificou, corte o excesso ao redor do tecido. Encha a bandeja de tampão com PBS. Oriente o cérebro com o eixo caudal rostral do tecido perpendicular à bandeja e corte 250 fatias de micrômetros usando um vibratome.
Encha uma placa de Petri de 3,5 centímetros com dois mililitros de mídia pré-aquecida, em seguida, use uma pipeta Pasteur de plástico para transferir 10 a 15 fatias para este prato. Quando terminar, transfira a placa de Petri com as fatias para a incubadora de cultura de fatias. Mantenha as fatias a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada.
Ligue o computador, microscópio, câmera de microscópio, manipuladores, plataforma de pressão e sensor de pressão. Carregue o aplicativo clicando no arquivo, aplicativo de lançamento.py na pasta principal baixada do GitHub e especifique as configurações do dispositivo na tela pop-up.
Para evitar entupimentos indesejados, crie uma pressão externa antes de submergir a pipeta na solução. Deslize a barra de pressão de compensação para 24 a 45% e clique em definir valores. Em seguida, ajuste a pressão girando o botão da válvula de pressão mecânica para um a dois PSI, conforme indicado pelo sensor de pressão.
Transfira as fatias para o centro de uma placa de Petri de 3,5 centímetros contendo dois mililitros de SIM pré-aquecido, em seguida, coloque a placa de Petri no estágio de microinjeção que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius. Carregue a pipeta de microinjeção com 1,4 a 1,6 microliters de solução de microinjeção usando uma pipeta de plástico de ponta longa e insira a pipeta de microinjeção no suporte da pipeta. Usando a menor ampliação no microscópio, leve a fatia em foco e guie a micropipette para este campo de visão para que ela se concentre no mesmo plano que o alvo da fatia.
Mude a saída do microscópio para a câmera para ver o FOV e o aplicativo. Clique no botão de ampliação no canto superior esquerdo da interface para iniciar a calibração do dispositivo. Quando uma janela solicitar a seleção da ampliação, selecione o 10X e pressione OK. O software assume que a lente objetiva interna é 10X.
Refoque a ponta da pipeta usando a roda micrométrica do microscópio e clique na ponta da pipeta com o cursor. Em seguida, pressione o botão passo 1.1 e pressione OK na janela pop-up. A pipeta se moverá na direção y.
Clique na ponta da pipeta e pressione o botão passo 1.2. Por fim, digite 45 na caixa de ângulo de pipeta e pressione o ângulo definido. Digite os parâmetros desejados no painel de controles de microinjeção automatizado e defina a velocidade para 100% Quando terminar, clique em definir valores.
Clique no botão desenhar borda e arraste o cursor ao longo da trajetória desejada na janela pop-up para definir a trajetória da injeção. Para microinjetorar neurônios, direja o lado basal do telencephalon. Leve a pipeta para o início da linha e clique na ponta, em seguida, clique na trajetória de execução para iniciar a microinjeção.
Repita este passo para cada plano de injeção direcionado. Mergulhe as fatias na mistura de colágeno, depois transfira as fatias junto com 200 a 300 microliters do colágeno em um poço de 14 milímetros de um prato de fundo de vidro de 35 milímetros. Certifique-se de que as fatias estão cobertas na menor quantidade de colágeno possível, que é a condição ideal para nutrientes e absorção de oxigênio.
Oriente as fatias usando dois pares de fórceps e incubar a placa de Petri por cinco minutos a 37 graus Celsius em um bloco de aquecimento para permitir que o colágeno se solidifique. Mova a placa de Petri de volta para a incubadora de cultura de fatias por mais 40 minutos, em seguida, adicione dois mililitros de SCM pré-aquecido. No final da cultura, tire as fatias da incubadora de cultura de fatias e aspire o SCM.
Lave as fatias embutidas de colágeno com PBS, depois adicione 4% de paraformaldeído e deixe o tecido em temperatura ambiente por 30 minutos. Mova-o para quatro graus Celsius para fixação durante a noite. No dia seguinte, aspire a solução de paraformaldeído e lave as fatias com PBS.
Remova as fatias do colágeno usando dois pares de fórceps sob um microscópio estéreo. Use um micro-ondas para derreter o ponto de fusão 3% baixo, em seguida, despeje-o em um molde descartável de incorporação e deixe esfriar a aproximadamente 38 ou 39 graus Celsius. Transfira as fatias de tecido para este molde certificando-se de que o lado da casca da fatia está voltado para cima, em seguida, deixe a agarose esfriar à temperatura ambiente e solidificar.
Corte a agarose extra em torno das fatias. Oriente o bloco de agarose para garantir que a superfície de corte seja paralela à lâmina de corte do vibratome e corte seções de 50 micrômetros de espessura. Encha um prato de 24 poços com PBS e transfira as seções para este prato usando um pincel de ponta fina, em seguida, realize a imunofluorescência de acordo com os protocolos padrão.
Imagens representativas de células progenitoras injetadas com sucesso e neurônios recém-nascidos são mostradas aqui. Quando injetadas com o Dextran Alexa 488, as células aparecem totalmente preenchidas com o corante. A microinjeção automatizada pode fornecer um rendimento significativamente maior em comparação com a microinjeção manual.
Além disso, a rotulagem edu confirma que a viabilidade celular não é afetada pela automação. Manter a fatia organotípica na cultura torna possível seguir a progressão da linhagem das células microinjetadas. A microinjeção em células-tronco neurais únicas fornece excelente resolução de células únicas.
Portanto, tem sido usado para dissecar a biologia celular da progressão de células-tronco neurais e a transição do destino. Este protocolo foi utilizado para estudar o acoplamento juncional em neurônios recém-nascidos, injetando amarelo Lúcifer junto com o Dextran A555. Uma proporção de neurônios piramimatais recém-nascidos foram acoplado através de junções de lacunas aos neurônios vizinhos, o que é consistente com a ideia de que neurônios imaturos se comunicam através da junção de lacunas.
Usamos essa técnica para investigar a biologia celular do desenvolvimento cerebral e da evolução cerebral. Estudamos vários genes candidatos que estavam afetando o comportamento das células-tronco neurais e fomos capazes de descobrir e entender como eles funcionam, como eles afetam a progressão da linhagem de células-tronco neurais e a produção de neurônios durante o desenvolvimento cerebral.
