Esta técnica permite dar una mirada más cercana a las células individuales en el tejido vivo. Mediante el seguimiento y la manipulación de células individuales, podemos entender mejor la formación de tejidos durante el desarrollo. La demostración visual de este método permite a los usuarios potenciales decidir si esta técnica podría ser útil para su trabajo.
Además, permite a los usuarios ver cómo se ejecuta la aplicación, lo que sería difícil de captar solo del texto. Este protocolo se puede aplicar a cada tejido con una superficie evaluable. Hemos estado apuntando a diferentes células en los mismos tejidos, diferentes tejidos en la misma especie, y también diferentes especies.
Al intentar este protocolo, es importante mantenerse enfocado y trabajar rápidamente. Todo el equipo debe estar preparado antes de iniciar la disección. Comience instalando el software de autoinyección y tirando de las pipetas de microinyección de los capilares de vidrio borosilicato con el tirador de micropipetas.
Guarde las pipetas durante un máximo de tres días protegidas del polvo. Derretir una agarosa de 3% de amplio alcance con horno microondas. No deje que la agarosa se solidifique manteniéndola en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Descongelar una alícuota un SCM y calentar de 10 a 12 mililitros SIM y 20 mililitros de la solución de Tyrode a 37 grados centígrados usando un baño de agua. Mezclar el trazador fluorescente con los otros productos químicos a inyectar, luego centrifugar la solución de microinyección a 16.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo.
Mantenga la solución de microinyección sobre hielo hasta su uso. Utilice las cabezas de los embriones de ratón E13.5 a E16.5 para preparar rebanadas de tejido organotípico del telencéfalo. Retire la piel y abra el cráneo con fórceps moviéndose a lo largo de la línea media.
Diseccionar el cerebro embrionario del cráneo abierto y eliminar las meninges que cubren el tejido cerebral a partir del lado ventral del cerebro. Deje el cerebro entero diseccionado en la solución de Tyrode en el bloque de calentamiento de 37 grados Celsius. Verter la amplia gama de agarrose derretida en un molde de incrustación desechable.
Cuando se enfríe a 38 a 39 grados Celsius, transfiera cuidadosamente hasta cuatro cerebros a la agarosa usando una pipeta Pasteur. Revuelva la agarosa alrededor del tejido con una espátula o un par de fórceps número uno de Dumont sin tocar el tejido. Dejar que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente.
Una vez que la agarosa se ha solidificado, recortar el exceso que rodea el tejido. Llene la bandeja del buffer con PBS. Orientar el cerebro con el eje caudal rostral del tejido perpendicular a la bandeja y cortar rodajas de 250 micrómetros utilizando un vibratome.
Llene un plato de Petri de 3,5 centímetros con dos mililitros de medios precalgados, luego use una pipeta pasteur de plástico para transferir de 10 a 15 rodajas a este plato. Cuando haya terminado, transfiera el plato petri con las rodajas a la incubadora de cultivo de rebanadas. Mantenga las rodajas a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada.
Encienda el ordenador, el microscopio, la cámara del microscopio, los manipuladores, la plataforma de presión y el sensor de presión. Cargue la aplicación haciendo clic en el archivo, inicie la aplicación.py en la carpeta principal descargada de GitHub y especifique la configuración del dispositivo en la pantalla emergente.
Para evitar obstrucciones no deseadas, cree una presión externa antes de sumergir la pipeta en la solución. Deslice la barra de presión de compensación a 24 a 45% y haga clic en establecer valores. A continuación, ajuste la presión girando la perilla de la válvula de presión mecánica a uno o dos PSI como lo indica el sensor de presión.
Transfiera las rodajas al centro de un plato de Petri de 3,5 centímetros que contenga dos mililitros de SIM precalentado, luego coloque el plato Petri en la etapa de microinyección que se ha precalentado a 37 grados centígrados. Cargue la pipeta de microinyección con 1,4 a 1,6 microlitros de solución de microinyección utilizando una pipeta de plástico de punta larga e inserte la pipeta de microinyección en el soporte de la pipeta. Con el aumento más bajo en el microscopio, ponga la rebanada en foco y guíe la micropipeta a este campo de visión para que se centre en el mismo plano que el objetivo de la rebanada.
Cambie la salida del microscopio a la cámara para ver el FOV y la aplicación. Haga clic en el botón de ampliación en la parte superior izquierda de la interfaz para iniciar la calibración del dispositivo. Cuando una ventana solicite seleccionar la ampliación, seleccione 10X y pulse OK. El software asume que la lente objetivo interna es 10X.
Reenfoque la punta de la pipeta con la rueda micrométrica del microscopio y haga clic en la punta de la pipeta con el cursor. A continuación, pulse el botón paso 1.1 y pulse OK en la ventana emergente. La pipeta se moverá en la dirección Y.
Haga clic en la punta de la pipeta y pulse el botón paso 1.2. Por último, introduzca 45 en el cuadro de ángulo de la pipeta y pulse el ángulo establecido. Introduzca los parámetros deseados en el panel de controles automatizados de microinyección y establezca la velocidad en 100%Cuando haya terminado, haga clic en establecer valores.
Haga clic en el botón de borde de dibujo y arrastre el cursor a lo largo de la trayectoria deseada en la ventana emergente para definir la trayectoria de la inyección. Para las neuronas microinyección, apunte al lado basal del telencéfalo. Lleve la pipeta al inicio de la línea y haga clic en su punta, luego haga clic en Ejecutar trayectoria para iniciar la microinyección.
Repita este paso para cada plano de inyección dirigido. Sumerja las rodajas en la mezcla de colágeno, luego transfiera las rodajas junto con 200 a 300 microlitros del colágeno en un pozo de 14 milímetros de un plato inferior de cristal de 35 milímetros. Asegúrese de que las rodajas estén cubiertas en la menor cantidad de colágeno posible, que es la condición óptima para la absorción de nutrientes y oxígeno.
Orientar las rodajas usando dos pares de fórceps e incubar el plato Petri durante cinco minutos a 37 grados Celsius en un bloque de calentamiento para permitir que el colágeno se solidifique. Mueva el plato Petri de nuevo a la incubadora de cultivo de rebanadas durante 40 minutos adicionales, luego agregue dos mililitros de SCM precalegado. Al final del cultivo, saque las rebanadas de la incubadora de cultivo de rebanadas y aspire el SCM.
Lave las rodajas incrustadas en colágeno con PBS, luego agregue un 4%de paraformaldehído y deje el tejido a temperatura ambiente durante 30 minutos. Muévelo a cuatro grados Centígrados para la fijación durante la noche. Al día siguiente, aspirar la solución de paraformaldehído y lavar las rodajas con PBS.
Retire las rodajas del colágeno utilizando dos pares de fórceps bajo un microscopio estéreo. Utilice un microondas para derretir el 3% bajo punto de fusión de agarosa, luego vierta en un molde de incrustación desechable y déjelo enfriar a aproximadamente 38 o 39 grados Celsius. Transfiera las rodajas de tejido a este molde asegurándose de que el lado de la cáscara de la rebanada está mirando hacia arriba, luego deje que la agarosa se enfríe a temperatura ambiente y se solidifique.
Recorta la agarosa extra que rodea las rodajas. Oriente el bloque de agarosa para asegurarse de que la superficie de corte es paralela a la cuchilla de corte del vibratome y corte secciones de 50 micrómetros de espesor. Llene un plato de 24 pozos con PBS y transfiera las secciones a este plato usando un pincel de punta fina, luego realice la inmunofluorescencia de acuerdo con los protocolos estándar.
Aquí se muestran imágenes representativas de células progenitoras inyectadas con éxito y neuronas recién nacidas. Cuando se inyecta con Dextran Alexa 488, las células aparecen completamente llenas con el tinte. La microinyección automatizada puede proporcionar un rendimiento significativamente mayor en comparación con la microinyección manual.
Además, el etiquetado EDU confirma que la viabilidad celular no se ve afectada por la automatización. Mantener la rebanada organotípica en el cultivo permite seguir la progresión del linaje de las células microinyeccionadas. La microinyección en células madre neurales individuales proporciona una excelente resolución de una sola célula.
Por lo tanto, se ha utilizado para diseccionar la biología celular de la progresión de células madre neurales y la transición del destino. Este protocolo se utilizó para estudiar el acoplamiento de unión en las neuronas recién nacidas inyectando Lucifer amarillo junto con Dextran A555. Una proporción de neuronas piramidales recién nacidas se acoplaron a través de unión de brechas a las neuronas vecinas, lo que es consistente con la idea de que las neuronas inmaduras se comunican a través de la unión de brechas.
Hemos utilizado esta técnica para investigar la biología celular del desarrollo cerebral y la evolución cerebral. Estudiamos varios genes candidatos que estaban afectando el comportamiento de las células madre neurales y pudimos descubrir y entender cómo funcionan, cómo afectan la progresión del linaje de células madre neurales y la producción de neuronas durante el desarrollo cerebral.
