Protokol, oositteki mitokondriyal DNA kopya sayısını önemli ölçüde azaltır. Bu, tür içi klonlama için faydalı olabilir. Bu yöntem, sığır oositlerindeki mitokondriyal DNA kopya sayılarını% 90'ın üzerinde azaltır ve bu da klonlanmış embriyolarda mitokondriyal heteroplazmi insidansını azaltabilir.
Laboratuvarımdan doktora öğrencisi Laura Adams, prosedürü gösterecek. Başlamak için, bir pipet kullanarak, seçilen olgun oositleri HSOF damlasından toplayın ve bunları HSOF CB çözeltisinin 50 mikrolitresini içeren 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin. Yumurtaları 12 dakika boyunca 15.000 kez G'de santrifüj edin.
Yumurtalar santrifüj edilirken, biseksiyon plakasını hazırlayın. Bunun için, damla başına 20 mikrolitre kullanarak 60 milimetrelik bir Petri kabının kapağında bir desen yaparak başlayın ve damlaları mineral yağ ile tamamen örtün. İnce uçlu bir işaretleyici kullanarak, tabağın altındaki çizgileri işaretleyin.
Mikrodamlaların ozmolarite değişikliklerini önlemek için santrifüjleme tamamlanana kadar kabı opak bir kapakla örtün. Santrifüjleme tamamlanır tamamlanmaz, çözelti içindeki yumurtaları toplamak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve yumurtaları HSOF damlalarıyla yıkamadan önce dört, 400 mikrolitre HSOF damlalı yeni bir arama plakasının boş bir kısmına taşıyın. Isıtma aşamasını 38,5 santigrat dereceye getirin.
Santrifüjlü oositleri HSOF damlasından biseksiyon plakasının sol üst T2 damlasına taşımak için bir ağız pipeti kullanın. Daha sonra yumurtaları üst sıradaki sonraki üç damla boyunca yıkayın. Yumurtaları pronaz damlalarından birine koyun, aralarında çok az temas olduğundan veya hiç temas olmadığından emin olun.
Zonae pellucidae'de belirgin bir deformasyon olana kadar yumurtaları gözlemleyin. Tek bir oosit zona pellucida deforme olduğunda, bu oositi komşu T2 damlasına taşıyın. Ek oositler deforme olurken, tüm oositler pronazdan çıkarılıp T2 damlasına yerleştirilene kadar tekrarlayın.
Zona pellucida'nın sadece ince bir tabakası kalana kadar yumurtaları gözlemleyin. Yumurtaları sıra içindeki sonraki üç damla boyunca yıkayın, ardından CBT20 damlaları içinde dikey çizgiler halinde biriktirin. Dikey çizgilerde daha az oosit ile başlayın ve biseksiyon becerileri ilerledikçe damla başına oosit sayısını artırın.
Oositler içeren ilk, en soldaki CBT20 damlasına odaklanın ve yumurtaları döndürmek için bir ağız pipeti kullanın, böylece her oositin mitokondri yoğun kısmı mikroskopun koluna bakacak veya uzakta olacaktır. Mikrobıçağın ucunu, mitokondri yoğun kısmın hemen üzerindeki boşluğa paralel olarak, en üstteki oositin soluna yerleştirin. Bıçağın ucunu aynı yerde tutarak, yumurtanın içinden tamamen kesmek için bıçağı dikkatlice indirin.
Mitokondri yoğun ooplast ve mitokondri indirgenmiş ooplastın yaklaşık olarak aynı boyutta olduğundan ve bıçağın santrifüjlü oositin en berrak segmentinde ikiye bölündüğünden emin olun. Bıçağı kaldırırken, aynı çizginin korunduğundan ve bıçağın ucunun aynı yerde kaldığından emin olun, ardından ucu plakadan yavaşça kaldırın. İlk biseksiyon damlasındaki tüm oositler için biseksiyon adımlarını tekrarlayın.
Ek damlalarda oositler varsa, kalan yumurtaları yönlendirin ve ikiye bölün. Bir ağız pipeti kullanarak, ilk biseksiyon damlasından mitokondri indirgenmiş ooplastları toplayın. Bunları plakanın alt satırında bulunan sol taraftaki T20 damlasına yerleştirin.
Kalan tüm biseksiyon damlaları için tekrarlayın. Bir ağız pipeti kullanarak, ilk biseksiyon damlasından mitokondri yoğun ooplastları toplayın. Bunları plakanın alt satırında bulunan sağ taraftaki T20 damlasına yerleştirin.
Kalan tüm biseksiyon damlaları için tekrarlayın. T10 dört kuyucuklu tabağı inkübatörden alın. Bir ağız pipeti kullanarak, tüm mitokondri indirgenmiş ooplastları iyi etiketlenmiş MR'ye taşıyın ve mitokondri yoğun ooptları iyi etiketlenmiş M.Dört delikli plakayı karbondioksit kontrollü inkübatöre geri yerleştirin.
Ooblastların mtDNA'nın nicelleştirilmesinden önce en az 30 dakika dinlenmesine izin verin. Başarılı bir biseksiyon için, tüm oositlerden ve mitokondri yoğun ooblastlardan alınan örnekler benzer BT değerlerine sahiptir. Mitokondri indirgenmiş ooplastlardan alınan örnekler, diğer iki gruptan alınan örneklere kıyasla daha yüksek BT değerlerine sahiptir.
Başarısız bir biseksiyon için, biseksiyon, mitokondri indirgenmiş ooplastlarda mtDNA içeriğini etkili bir şekilde azaltmaz. Standart bir eğrinin üretilmesini ve sağlanan mtDNA kopya sayısı formüllerinin kullanılmasını takiben, bu protokol kullanılarak ortalama %93.88'lik bir oosit mtDNA azalması sağlanmıştır. Biseksiyon damlasındaki her oositi doğru bir şekilde yönlendirmek, her oositi tam olarak ikiye bölmek ve ooplastları doğru bir şekilde sıralamak, başarılı sonuçlar elde etmek için atılması gereken kritik adımlardır.
İki ooplast, bir somatik hücre ile kaynaştırılabilir. Kaynaşmış üçüzler daha sonra kimyasal olarak aktive edilebilir ve yeniden yapılandırılmış embriyolar olarak kültürlenebilir.
