Harvard Tıp Fakültesi'ndeki Biyopolimerler Tesisi'nden biyoanalizör için teknik yardım aldık. Bu çalışma Ulusal Multipl Skleroz Derneği araştırma hibesi RG-1707-28516 (H.L.W. ve S.L.) tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan araştırma hayvanlarını içeren tüm yöntemler, Harvard Tıp Fakültesi Brigham ve Kadın Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
Burada açıklanan insan araştırma konularını içeren tüm yöntemler, Ortaklar İnsan Araştırma Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur.
1. Fekal numune toplama
<ol><li>Bir deneydeki her hayvan deneği için vidalı kapaklı steril ve nükleaz içermeyen 2 mL mikrosantrifüj tüpünü otoklav yapın veya hazırlayın.<ol><li>İnsan denekler için, her denek için uygun, nükleaz içermeyen ve steril bir dışkı örneği toplama cihazı sağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Her hayvan deneklerinden 25-100 mg (fare dışkı örnekleri için yaklaşık 1-4 dışkı peleti) dışkı örneğini steril bir ortamda toplayın. NOT: En yüksek saflıkta RNA elde etmek için iki veya daha fazla dışkı peleti (~ 50 mg veya daha ağır) tercih edilir.<ol><li>Gerekli tüm Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) ve malzemeleri kullanın, örneğin: dışkı numunesi kontaminasyonunu önlemek için hayvan araştırma konusunun yerleştirildiği çalışma alanını sterilize etmek için bir çift laboratuvar eldiveni, bir dezenfektan spreyi ve steril bir kağıt havlu.<ol><li>İnsan denekler için, her araştırma deneğine / toplayıcıya mümkün olduğunca steril bir ortamda 100-200 mg dışkı örneği toplamasını söyleyin. Standart steril çalışma kullanın ve dışkı numunesi kontaminasyonundan kaçının.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Kontaminasyonu önlemek için her bir hayvan deneklerinden dışkı numunelerini, diğer yüzeylere dokunmadan vidalı kapaklı 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne doğrudan toplayın.<ol><li>İnsan denekler için, kontaminasyonu önlemek için her bir deneğe doğrudan sağlanan uygulanabilir bir toplama cihazına (örneğin, steril bir dışkı numunesi toplama kiti) dışkılama talimatı verin. NOT: Tuvalet yüzeyleri, su, idrar veya diğer steril olmayan yüzeyler/nesneler tarafından kontaminasyondan kaçınılması için konuya talimat verin.</li>
	</ol></li>
	<li>2 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplanan dışkı örneklerini hemen -80 ° C'de dondurun veya aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi dışkı yeniden süspansiyonundan önce RNA'nın daha iyi miktarı ve kalitesi için bir kova kuru buz içine yerleştirin.<ol><li>İnsan dışkı örnekleri için, 200 mg'lık her taze numuneyi vidalı kapaklarla 2 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve dışkı aşağıda açıklandığı gibi yeniden süspansiyondan önce -80 ° C'de dondurun.<ol><li>Vidalı kapaklı 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde olmayan dışkı örneklerinin depolanması için, dondurulmuş numunelerin her birini tartın ve aşağıda açıklandığı gibi dışkı yeniden süspansiyonundan önce vidalı kapaklı ayrı 2 mL mikrosantrifüj tüplerine 100-200 mg aktarın. NOT: İnsan dışkı örnekleri için, RNA izolasyonu için 200 mg'dan fazla dışkı örneği almaktan kaçının, çünkü aşağıdaki adımlarda zorluklara neden olabilir. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde aşırı yüklenmiş bir numune ile, sulu faz, organik faz ve interfaz net bir şekilde oluşturulamayabilir ve ayrılamayabilir. Prosedür burada duraklatılabilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Yıkama çözeltilerinin hazırlanması
<ol><li>Şişede gösterildiği gibi 30 mL'lik son hacme ulaşmak için miRNA İzolasyon Kitinde sağlanan Yıkama Çözeltisi 1'e 21 mL Amerikan Kimya Derneği (ACS) dereceli% 100 etanol ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Her şey şişede çözülene kadar vorteks.</li>
	<li>Şişede gösterildiği gibi 50 mL'lik son hacme ulaşması sağlanan Yıkama Çözeltisi 2/3'e 40 mL ACS kaliteli% 100 etanol ekleyin. 5 s boyunca veya son karışım iyice harmanlanana kadar vorteks.</li>
</ol>3. Ekipman ve malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Çalışma alanını ve ekipmanı, örneğin: laboratuvar tezgahına, kimyasal duman davlumbazındaki çalışma alanına ve mikro santrifüj tüp raflarına, bir Ribonükleaz (RNase) dekontaminasyon çözeltisi (örneğin, ticari olarak temin edilebilen RNaz dekontaminasyon çözeltisi) ile püskürtün. Kontaminasyonu önlemek için, RNase dekontaminasyon çözeltisi ile gerekli görülen her yerde ve her zaman yüzeylere uygulayın.</li>
	<li>Temiz bir laboratuvar önlüğü giyin, yüz maskesi takın ve dışkı örneklerindeki RNA'yı insan derisinde bulunan nükleazlardan korumak için uygun laboratuvar eldivenleri giyin. Eldivenleri RNase dekontaminasyon çözeltisi ile püskürtün ve kontaminasyonu önlemek için eldivenleri sık sık değiştirin.</li>
	<li>Dışkı yeniden süspansiyonundan önce çözülmeyi önlemek için -80 ° C'de depolanan dışkı örnekleri için bir kova kuru buz ve malzemeler için bir kova buz hazırlayın, örneğin: Asit-Fenol: Kloroform, raf ömrünü uzatmak için. NOT: Protokolde kullanılan ortam da dahil olmak üzere malzemelerin nükleazların kontaminasyonu olmadan steril olduğundan emin olun.</li>
</ol>4. Dışkı süspansiyonu
<ol><li>600 μL steril 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) 25-100 mg dışkı örneğini yeniden askıya alın. DİKKAT: Dışkı örnekleri, numunedeki hücreler çözüldüğünde buz kristalleri hem iç hem de dış hücresel bölmeleri yırttığından, RNazların ve hücresel RNA'nın salınımını en aza indirmek için kısmi çözülme bile olmadan -80 ° C'den çözüldüğünde derhal işlenmelidir.<ol><li>Oda sıcaklığında (RT) dışkı örnekleri içeren vidalı kapaklı 2 mL mikrosantrifüj tüpüne 600 μL 1x DPBS ekleyin.</li>
		<li>RT'de 30 dakika boyunca kapatılmış 2 mL mikrosantrifüj tüpünde 600 μL 1x DPBS'ye batırılmış dışkı örneklerinin karışımını inkübe edin.</li>
		<li>1 mL pipet ucu ve vorteks kuyusu ile ezerek karışımı 2 mL mikrosantrifüj tüpü kapatılmış olarak yeniden askıya alın. RNA'nın miktarını ve kalitesini optimize etmek ve arttırmak için, karışımı S4000 (veya 4000 rpm) ve 45 s'de bir döngü ayarına sahip bir homojenizatör ile yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Organik ekstraksiyon
DİKKAT: Tehlikeli kimyasal duman başlığını asit-fenol kullanımı ile Adım 6'ya kadar aşağıdaki adımlar için kullanın: kloroform ve ACS sınıfı% 100 etanol, toksisiteleri ve yanıcılıkları nedeniyle. KKD'yi gerektiği gibi değiştirin ve tehlikeli maddelerle çalışırken uygun standart önlemleri alın.
<ol><li>RNA'yı 600 μL asit-fenol ile ekstrakte edin: kloroform (gerekli asit-fenol hacmi: gerekli kloroform, Adım 4.1'de eklenen 1x DPBS'nin başlangıç hacmine eşittir).<ol><li>Adım 4.1'den itibaren süspansiyona 600 μL asit-fenol ekleyin: kloroform. NOT: Asit-fenol çekin: üst faz sulu bir tamponla karıştırıldığı için şişedeki alt fazdan kloroform. Bu iki faz arasındaki interfaz bozulursa, asit-fenol'ü bekleyin ve geri çekin: kloroform, yalnızca interfaz kontaminasyonu önlemek için kendini yeniden kurduğunda.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorteks karışımı 60 s iyice karıştırmak için. Alternatif olarak, verimdeki RNA miktarını optimize etmek ve arttırmak için, S4000 ve 45 s'de bir döngü ayarına sahip bir homojenizatör kullanarak karıştırın.</li>
	<li>Sulu ve organik fazları bir mikrosantrifüj ile ayırmak için RT'de 10.000 x g'da 15 dakika santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, interfaz kompakt olmalıdır. Değilse, santrifüjlemeyi tekrarlayın. NOT: Eğer interfaz, başlangıç hacminin eklenen asit-fenol hacmine eşit olmayan oranı nedeniyle istenildiği kadar kompakt olamıyorsa: birkaç santrifüjleme tekrarından sonra kloroform, kontaminasyonu önlemek için sulu fazı daha dikkatli bir şekilde geri kazanmaya devam edin.</li>
	<li>Sulu fazı geri kazanın ve menteşe kapaklı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (miRNA izolasyon kiti tarafından sağlanmaz).<ol><li>Sulu (veya üst) fazı, alt fazı rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın ve menteşe kapaklı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aktarılan hacme dikkat edin (örneğin, ~500 μL). NOT: İnterfaz kompakt olduğunda ve üst faz açıkça ayrıldığında, muhtemelen sulu fazın üstünde yüzen birkaç küçük artık parçacık vardır. Bu kalıntıları önlemek için pipeti dikkatli bir şekilde kullanın ve sulu fazın sadece küçük bir hacmini elde edebilseniz bile, kaliteli bir RNA verimi sağlamak için sadece gözle görülür ve net bir şekilde ayrılmış sulu fazı geri kazanın.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Son RNA izolasyonu
<ol><li>2 mL mikrosantrifüj tüpündeki sulu faza 1.25 hacim RT ACS dereceli% 100 etanol ekleyin (örneğin, Adım 5.4'ten 500 μL sulu faz geri kazanılırsa 625 μL% 100 etanol ekleyin). Vorteks 3 s.</li>
	<li>Sulu faz/etanol karışımını miRNA izolasyon kitinde verilen filtre kartuşundan yükleyin.<ol><li>Her numune için, filtre kartuşunu kit tarafından sağlanan toplama tüplerinden birine yerleştirin.<ol><li>Pipet ve sulu faz/etanol karışımının 600 μL'sini filtre kartuşuna yükleyin. NOT: Pipetlemeden önce etanolün sulu faz ile iyice karıştırılması için karışımı kısa bir süre vortekse edin. Bir seferde sulu faz/etanol karışımının en fazla 700 μL'si yüklenemez.</li>
		</ol></li>
		<li>Karışımın içinden filtrelemek için 90 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Daha yüksek hızda eğirmek filtreye zarar verebilir.</li>
		<li>Filtratın ve birbirini izleyen uygulamalarda tüm karışım aynı filtre membranından filtrelenene kadar Adım 6.2.1 ila 6.2.2'yi tekrarlayın. Aşağıdaki yıkama adımları için aynı toplama tüpünü saklayın ve tekrar kullanın.</li>
		<li>Filtreyi 700 μL miRNA Yıkama Çözeltisi 1 ile yıkayın. DİKKAT: miRNA Yıkama Çözeltisi 1, cilt tahrişine ve ciddi göz hasarına neden olabilecek guanidin tiyosiyanat içerir. Gerekli KKD'leri giyin, örneğin: eldivenler, yüz siperliği, koruyucu laboratuvar önlüğü. Gerektiğinde eldivenleri sık sık değiştirin.<ol><li>ACS sınıfı% 100 etanol ile hazırlanan çalışma çözeltisi olan 700 μL miRNA Yıkama Çözeltisi 1'i filtre kartuşuna uygulayın.</li>
			<li>miRNA Yıkama Çözeltisi 1'i filtre kartuşundan filtrelemek için 60 sn'lik santrifüj.</li>
			<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Filtreyi her biri 700 μL, 500 μL ve 250 μL hacimlerde art arda 2/3 Yıkama Çözeltisi ile yıkayın.<ol><li>ACS sınıfı %100 etanol ile hazırlanan çalışma çözeltisi olan 700 μL Yıkama Çözeltisi 2/3'ü filtre kartuşuna uygulayın.<ol><li>1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.</li>
				<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.</li>
			</ol></li>
			<li>Filtre kartuşuna 500 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 uygulayın.<ol><li>1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.</li>
				<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.</li>
			</ol></li>
			<li>Filtre kartuşuna 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 uygulayın.<ol><li>1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.</li>
				<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın.</li>
			</ol></li>
			<li>Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve artık sıvıyı filtreden çıkarmak için tertibatı 5 dakika boyunca döndürün.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. 50 μL nükleaz içermeyen su ile Elute RNA
<ol><li>Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Pipetle 50 μL nükleaz içermeyen suyu filtrenin ortasına yerleştirin ve toplama tüpünü kapatın.<ol><li>RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>RNA'yı yeni toplama tüpüne geri kazandırmak için 8.000 x g'de 5 dakika boyunca döndürün.</li>
		<li>Bir florometre kullanarak geri kazanılan dışkı RNA'sının konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. Geri kazanılan fekal RNA -80 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Yazarlar, bu protokol makalesinde açıklanan araştırma yöntemiyle ilgili veya maddi hiçbir finansal çıkar beyan etmemektedir.

İzolasyon sırasında RNaz kontaminasyonunu önlemek için RNase içermeyen tekniğin kullanılması önemlidir7. Santrifüjleme ve kompakt bir interfazın oluşumundan sonra, sulu fazı geri kazanırken interfaz, alt faz ve sulu fazın üstünde yüzen partikül kirleticisinden kaçınmak önemlidir. Ek olarak, optimize edilmiş kalite için filtre membranındaki kirleticileri ortadan kaldırmak üzere 500 μL ve 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 ile iki yıkama adımı eklenir. Ayrıca, 200 mg'da...

Hücre dışı RNA, birçok biyolojik sürece aracılık eden önemli bir faktör olarak kabul edilmektedir1. Dışkıda hücre dışı RNA ilk olarak 2008 yılında kolon kanseri ve aktif ülseratif kolit2 için bir belirteç olarak bildirilmiştir ve yakın zamanda bağırsak lümeninin ve dışkının normal bir bileşeni olarak ortaya çıkmıştır ve konakçı-mikrop iletişimine aracılık eder 3,4,5. Bu RNA izolasyon protokolünün amacı, hayvan ve insan deneklerden toplanan dışkı örneklerinden yüksek kaliteli hücre dışı RNA'yı çıkarmaktır. Protokol, ticari bir miRNA İzolasyon Kitinden uyarlandı. Elde edilen RNA, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için kullanılır. Protokol, hayvanların ve insanların dışkısında bulunan RNA'nın miktarını ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak için birkaç önemli ve yararlı ipucu içerir. RNA (mikroRNA dahil) izolasyonunun bu yöntemini geliştirmenin ve optimize etmenin nedeni, dışkıdaki mikrobiyal RNA'yı azaltmak, araştırma çalışmalarındaki değişkenleri sınırlamak ve çeşitli kafa karıştırıcı faktörleri ve kontaminasyon kaynaklarını hesaba katmadan bağırsaktaki RNA bileşimini analiz etmektir. Not olarak, bu RNA izolasyonu, RNA'nın canlı hücreden ve canlı mikroplardan (hücresel RNA) salınımını en aza indirir. Bağırsak hücreleri tarafından salınan veya gıda alımı yoluyla edinilen hücre dışı RNA'lara odaklanır. Temel olarak, bu yöntem mikrobiyal transkriptomun araştırıldığı çalışmalar için uygun değildir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

RNA'nın bağırsak lümeninde ve hayvanlarda ve insanlarda dışkıda var olduğu netleşiyor. Aşağıda açıklanan protokol, mikroRNA'lar da dahil olmak üzere toplam RNA'yı hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden izole eder. Amaç, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için toplam RNA'yı yüksek saflık ve miktarda izole etmektir. Bu optimize edilmiş protokolün miRNA izolasyonundaki avantajları, yüksek oranda saflaştırılmış RNA ürünlerini tarif edilen ek yıkama adımlarıyla izole etme yetenekleri, numunenin yeniden süspansiyonunda geliştirilmiş bir yöntemle elde edilen RNA miktarının artması ve önemli dekontaminasyon ipuçlarıdır. Bir sınırlama, 200 mg'dan daha büyük numunenin işlenememesi ve saflaştırılamamasıdır, çünkü bu numune büyüklükleri interfazın net oluşumunda bir zorluğa neden olacaktır. Sonuç olarak, büyük örneklem büyüklüğü, protokolde açıklandığı gibi ekstrakte edilecek sulu fazı, sonunda izole edilen RNA'nın kalitesini etkileyen organik maddelerle kirletebilir. Bununla birlikte, 200 mg'a kadar bir numuneden RNA izolatları, aşağı akış analizlerinin çoğu için yeterlidir.

Temsili RNA'lar sırasıyla 50 mg fare dışkı örneğinden (2 fare dışkı peleti) ve 100 mg insan dışkısı örneklerinden izole edildi ve 50 μL nükleaz içermeyen suda salındı. Konsantrasyonun spektrofotometre analizi, sırasıyla toplam 49 μg ve 16 μg RNA miktarının izole edildiğini göstermektedir (Tablo 1). RNA saflığı, ~2.0'lık bir A260 / A280 oranı ve ~ 1.8'lik bir A260 / A230 oranı ile gösterildiği gibi yüksekti (Tablo 1). Bildirilen3</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Fecal micro RNA Isolation

Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.

Fekal (mikro) RNA İzolasyonu

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

Fecal (micro) RNA Isolation

Diagnostic and Radiological Studies of the GI System

SCIENTISTS IN ACTION

4.5K Görüntüleme.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.

Video: Fecal micro RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

Keneler de RNA Girişim

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Çift iplikçikli RNA ve desen tanıma reseptörleri negatif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu confocal görüntüleme

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are needed to decipher the utilization of microbiome modulators for human health benefits. However, the large-scale screening and optimization of modulators to validate microbiome modulation and predict related health benefits may be practically difficult due to the need for large number of animals and/or human subjects. To this end, in vitro or ex vivo models can facilitate preliminary screening of microbiome modulators. Herein, it is optimized and demonstrated an ex vivo fecal microbiota culture system that can be used for examining the effects of various interventions of gut microbiome modulators including probiotics, prebiotics and other food ingredients, aside from nutraceuticals and drugs, on the diversity and composition of the human gut microbiota. Inulin, one of the most widely studied prebiotic compounds and microbiome modulators, is used as an example here to examine its effect on the healthy fecal microbiota composition and its metabolic activities, such as fecal pH and the fecal levels of organic acids including lactate and short-chain fatty acids (SCFAs). The protocol may be useful for studies aimed at estimating the effects of different interventions of modulators on fecal microbiota profiles and at predicting their health impacts.

This protocol describes an in vitro batch-culture fermentation system of human fecal microbiota, using inulin (a well-known prebiotic and one of the most widely studied microbiota modulators) to demonstrate the use of this system in estimating effects of specific interventions on fecal microbiota composition and metabolic activities.

Bir In vitro Batch-kültür modeli ınsan dışkı microbiota üzerinde girişimsel rejimlerin etkilerini tahmin etmek

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...