Harvard Tıp Fakültesi'ndeki Biyopolimerler Tesisi'nden biyoanalizör için teknik yardım aldık. Bu çalışma Ulusal Multipl Skleroz Derneği araştırma hibesi RG-1707-28516 (H.L.W. ve S.L.) tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan araştırma hayvanlarını içeren tüm yöntemler, Harvard Tıp Fakültesi Brigham ve Kadın Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
Burada açıklanan insan araştırma konularını içeren tüm yöntemler, Ortaklar İnsan Araştırma Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur.
1. Fekal numune toplama
<ol><li>Bir deneydeki her hayvan deneği için vidalı kapaklı steril ve nükleaz içermeyen 2 mL mikrosantrifüj tüpünü otoklav yapın veya hazırlayın.<ol><li>İnsan denekler için, her denek için uygun, nükleaz içermeyen ve steril bir dışkı örneği toplama cihazı sağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Her hayvan deneklerinden 25-100 mg (fare dışkı örnekleri için yaklaşık 1-4 dışkı peleti) dışkı örneğini steril bir ortamda toplayın. NOT: En yüksek saflıkta RNA elde etmek için iki veya daha fazla dışkı peleti (~ 50 mg veya daha ağır) tercih edilir.<ol><li>Gerekli tüm Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) ve malzemeleri kullanın, örneğin: dışkı numunesi kontaminasyonunu önlemek için hayvan araştırma konusunun yerleştirildiği çalışma alanını sterilize etmek için bir çift laboratuvar eldiveni, bir dezenfektan spreyi ve steril bir kağıt havlu.<ol><li>İnsan denekler için, her araştırma deneğine / toplayıcıya mümkün olduğunca steril bir ortamda 100-200 mg dışkı örneği toplamasını söyleyin. Standart steril çalışma kullanın ve dışkı numunesi kontaminasyonundan kaçının.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Kontaminasyonu önlemek için her bir hayvan deneklerinden dışkı numunelerini, diğer yüzeylere dokunmadan vidalı kapaklı 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne doğrudan toplayın.<ol><li>İnsan denekler için, kontaminasyonu önlemek için her bir deneğe doğrudan sağlanan uygulanabilir bir toplama cihazına (örneğin, steril bir dışkı numunesi toplama kiti) dışkılama talimatı verin. NOT: Tuvalet yüzeyleri, su, idrar veya diğer steril olmayan yüzeyler/nesneler tarafından kontaminasyondan kaçınılması için konuya talimat verin.</li>
	</ol></li>
	<li>2 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplanan dışkı örneklerini hemen -80 ° C'de dondurun veya aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi dışkı yeniden süspansiyonundan önce RNA'nın daha iyi miktarı ve kalitesi için bir kova kuru buz içine yerleştirin.<ol><li>İnsan dışkı örnekleri için, 200 mg'lık her taze numuneyi vidalı kapaklarla 2 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve dışkı aşağıda açıklandığı gibi yeniden süspansiyondan önce -80 ° C'de dondurun.<ol><li>Vidalı kapaklı 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde olmayan dışkı örneklerinin depolanması için, dondurulmuş numunelerin her birini tartın ve aşağıda açıklandığı gibi dışkı yeniden süspansiyonundan önce vidalı kapaklı ayrı 2 mL mikrosantrifüj tüplerine 100-200 mg aktarın. NOT: İnsan dışkı örnekleri için, RNA izolasyonu için 200 mg'dan fazla dışkı örneği almaktan kaçının, çünkü aşağıdaki adımlarda zorluklara neden olabilir. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde aşırı yüklenmiş bir numune ile, sulu faz, organik faz ve interfaz net bir şekilde oluşturulamayabilir ve ayrılamayabilir. Prosedür burada duraklatılabilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Yıkama çözeltilerinin hazırlanması
<ol><li>Şişede gösterildiği gibi 30 mL'lik son hacme ulaşmak için miRNA İzolasyon Kitinde sağlanan Yıkama Çözeltisi 1'e 21 mL Amerikan Kimya Derneği (ACS) dereceli% 100 etanol ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Her şey şişede çözülene kadar vorteks.</li>
	<li>Şişede gösterildiği gibi 50 mL'lik son hacme ulaşması sağlanan Yıkama Çözeltisi 2/3'e 40 mL ACS kaliteli% 100 etanol ekleyin. 5 s boyunca veya son karışım iyice harmanlanana kadar vorteks.</li>
</ol>3. Ekipman ve malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Çalışma alanını ve ekipmanı, örneğin: laboratuvar tezgahına, kimyasal duman davlumbazındaki çalışma alanına ve mikro santrifüj tüp raflarına, bir Ribonükleaz (RNase) dekontaminasyon çözeltisi (örneğin, ticari olarak temin edilebilen RNaz dekontaminasyon çözeltisi) ile püskürtün. Kontaminasyonu önlemek için, RNase dekontaminasyon çözeltisi ile gerekli görülen her yerde ve her zaman yüzeylere uygulayın.</li>
	<li>Temiz bir laboratuvar önlüğü giyin, yüz maskesi takın ve dışkı örneklerindeki RNA'yı insan derisinde bulunan nükleazlardan korumak için uygun laboratuvar eldivenleri giyin. Eldivenleri RNase dekontaminasyon çözeltisi ile püskürtün ve kontaminasyonu önlemek için eldivenleri sık sık değiştirin.</li>
	<li>Dışkı yeniden süspansiyonundan önce çözülmeyi önlemek için -80 ° C'de depolanan dışkı örnekleri için bir kova kuru buz ve malzemeler için bir kova buz hazırlayın, örneğin: Asit-Fenol: Kloroform, raf ömrünü uzatmak için. NOT: Protokolde kullanılan ortam da dahil olmak üzere malzemelerin nükleazların kontaminasyonu olmadan steril olduğundan emin olun.</li>
</ol>4. Dışkı süspansiyonu
<ol><li>600 μL steril 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) 25-100 mg dışkı örneğini yeniden askıya alın. DİKKAT: Dışkı örnekleri, numunedeki hücreler çözüldüğünde buz kristalleri hem iç hem de dış hücresel bölmeleri yırttığından, RNazların ve hücresel RNA'nın salınımını en aza indirmek için kısmi çözülme bile olmadan -80 ° C'den çözüldüğünde derhal işlenmelidir.<ol><li>Oda sıcaklığında (RT) dışkı örnekleri içeren vidalı kapaklı 2 mL mikrosantrifüj tüpüne 600 μL 1x DPBS ekleyin.</li>
		<li>RT'de 30 dakika boyunca kapatılmış 2 mL mikrosantrifüj tüpünde 600 μL 1x DPBS'ye batırılmış dışkı örneklerinin karışımını inkübe edin.</li>
		<li>1 mL pipet ucu ve vorteks kuyusu ile ezerek karışımı 2 mL mikrosantrifüj tüpü kapatılmış olarak yeniden askıya alın. RNA'nın miktarını ve kalitesini optimize etmek ve arttırmak için, karışımı S4000 (veya 4000 rpm) ve 45 s'de bir döngü ayarına sahip bir homojenizatör ile yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Organik ekstraksiyon
DİKKAT: Tehlikeli kimyasal duman başlığını asit-fenol kullanımı ile Adım 6'ya kadar aşağıdaki adımlar için kullanın: kloroform ve ACS sınıfı% 100 etanol, toksisiteleri ve yanıcılıkları nedeniyle. KKD'yi gerektiği gibi değiştirin ve tehlikeli maddelerle çalışırken uygun standart önlemleri alın.
<ol><li>RNA'yı 600 μL asit-fenol ile ekstrakte edin: kloroform (gerekli asit-fenol hacmi: gerekli kloroform, Adım 4.1'de eklenen 1x DPBS'nin başlangıç hacmine eşittir).<ol><li>Adım 4.1'den itibaren süspansiyona 600 μL asit-fenol ekleyin: kloroform. NOT: Asit-fenol çekin: üst faz sulu bir tamponla karıştırıldığı için şişedeki alt fazdan kloroform. Bu iki faz arasındaki interfaz bozulursa, asit-fenol'ü bekleyin ve geri çekin: kloroform, yalnızca interfaz kontaminasyonu önlemek için kendini yeniden kurduğunda.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorteks karışımı 60 s iyice karıştırmak için. Alternatif olarak, verimdeki RNA miktarını optimize etmek ve arttırmak için, S4000 ve 45 s'de bir döngü ayarına sahip bir homojenizatör kullanarak karıştırın.</li>
	<li>Sulu ve organik fazları bir mikrosantrifüj ile ayırmak için RT'de 10.000 x g'da 15 dakika santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, interfaz kompakt olmalıdır. Değilse, santrifüjlemeyi tekrarlayın. NOT: Eğer interfaz, başlangıç hacminin eklenen asit-fenol hacmine eşit olmayan oranı nedeniyle istenildiği kadar kompakt olamıyorsa: birkaç santrifüjleme tekrarından sonra kloroform, kontaminasyonu önlemek için sulu fazı daha dikkatli bir şekilde geri kazanmaya devam edin.</li>
	<li>Sulu fazı geri kazanın ve menteşe kapaklı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (miRNA izolasyon kiti tarafından sağlanmaz).<ol><li>Sulu (veya üst) fazı, alt fazı rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın ve menteşe kapaklı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aktarılan hacme dikkat edin (örneğin, ~500 μL). NOT: İnterfaz kompakt olduğunda ve üst faz açıkça ayrıldığında, muhtemelen sulu fazın üstünde yüzen birkaç küçük artık parçacık vardır. Bu kalıntıları önlemek için pipeti dikkatli bir şekilde kullanın ve sulu fazın sadece küçük bir hacmini elde edebilseniz bile, kaliteli bir RNA verimi sağlamak için sadece gözle görülür ve net bir şekilde ayrılmış sulu fazı geri kazanın.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Son RNA izolasyonu
<ol><li>2 mL mikrosantrifüj tüpündeki sulu faza 1.25 hacim RT ACS dereceli% 100 etanol ekleyin (örneğin, Adım 5.4'ten 500 μL sulu faz geri kazanılırsa 625 μL% 100 etanol ekleyin). Vorteks 3 s.</li>
	<li>Sulu faz/etanol karışımını miRNA izolasyon kitinde verilen filtre kartuşundan yükleyin.<ol><li>Her numune için, filtre kartuşunu kit tarafından sağlanan toplama tüplerinden birine yerleştirin.<ol><li>Pipet ve sulu faz/etanol karışımının 600 μL'sini filtre kartuşuna yükleyin. NOT: Pipetlemeden önce etanolün sulu faz ile iyice karıştırılması için karışımı kısa bir süre vortekse edin. Bir seferde sulu faz/etanol karışımının en fazla 700 μL'si yüklenemez.</li>
		</ol></li>
		<li>Karışımın içinden filtrelemek için 90 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Daha yüksek hızda eğirmek filtreye zarar verebilir.</li>
		<li>Filtratın ve birbirini izleyen uygulamalarda tüm karışım aynı filtre membranından filtrelenene kadar Adım 6.2.1 ila 6.2.2'yi tekrarlayın. Aşağıdaki yıkama adımları için aynı toplama tüpünü saklayın ve tekrar kullanın.</li>
		<li>Filtreyi 700 μL miRNA Yıkama Çözeltisi 1 ile yıkayın. DİKKAT: miRNA Yıkama Çözeltisi 1, cilt tahrişine ve ciddi göz hasarına neden olabilecek guanidin tiyosiyanat içerir. Gerekli KKD'leri giyin, örneğin: eldivenler, yüz siperliği, koruyucu laboratuvar önlüğü. Gerektiğinde eldivenleri sık sık değiştirin.<ol><li>ACS sınıfı% 100 etanol ile hazırlanan çalışma çözeltisi olan 700 μL miRNA Yıkama Çözeltisi 1'i filtre kartuşuna uygulayın.</li>
			<li>miRNA Yıkama Çözeltisi 1'i filtre kartuşundan filtrelemek için 60 sn'lik santrifüj.</li>
			<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Filtreyi her biri 700 μL, 500 μL ve 250 μL hacimlerde art arda 2/3 Yıkama Çözeltisi ile yıkayın.<ol><li>ACS sınıfı %100 etanol ile hazırlanan çalışma çözeltisi olan 700 μL Yıkama Çözeltisi 2/3'ü filtre kartuşuna uygulayın.<ol><li>1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.</li>
				<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.</li>
			</ol></li>
			<li>Filtre kartuşuna 500 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 uygulayın.<ol><li>1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.</li>
				<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.</li>
			</ol></li>
			<li>Filtre kartuşuna 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 uygulayın.<ol><li>1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.</li>
				<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın.</li>
			</ol></li>
			<li>Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve artık sıvıyı filtreden çıkarmak için tertibatı 5 dakika boyunca döndürün.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. 50 μL nükleaz içermeyen su ile Elute RNA
<ol><li>Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Pipetle 50 μL nükleaz içermeyen suyu filtrenin ortasına yerleştirin ve toplama tüpünü kapatın.<ol><li>RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>RNA'yı yeni toplama tüpüne geri kazandırmak için 8.000 x g'de 5 dakika boyunca döndürün.</li>
		<li>Bir florometre kullanarak geri kazanılan dışkı RNA'sının konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. Geri kazanılan fekal RNA -80 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+RNA+communication+consortium%3A+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li>
<li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+%26+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li>
<li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li>
<li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028(2009).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+win+the+battle+with+RNase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857(2019).</li>
<li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li>
<li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn%27s+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Crohn%27s+%26+Colitis%22%5BJournal%5D)">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's & Colitis. 2 (1), 003(2020).</li>
<li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li>
<li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70(2019).</li>
<li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Square%22%5BJournal%5D)">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li>
<li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li>
<li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faecal+microRNAs%3A+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Beneficial+Microbes%22%5BJournal%5D)">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li>
<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
</ol>

Yazarlar, bu protokol makalesinde açıklanan araştırma yöntemiyle ilgili veya maddi hiçbir finansal çıkar beyan etmemektedir.

İzolasyon sırasında RNaz kontaminasyonunu önlemek için RNase içermeyen tekniğin kullanılması önemlidir7. Santrifüjleme ve kompakt bir interfazın oluşumundan sonra, sulu fazı geri kazanırken interfaz, alt faz ve sulu fazın üstünde yüzen partikül kirleticisinden kaçınmak önemlidir. Ek olarak, optimize edilmiş kalite için filtre membranındaki kirleticileri ortadan kaldırmak üzere 500 μL ve 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 ile iki yıkama adımı eklenir. Ayrıca, 200 mg'da...

Hücre dışı RNA, birçok biyolojik sürece aracılık eden önemli bir faktör olarak kabul edilmektedir1. Dışkıda hücre dışı RNA ilk olarak 2008 yılında kolon kanseri ve aktif ülseratif kolit2 için bir belirteç olarak bildirilmiştir ve yakın zamanda bağırsak lümeninin ve dışkının normal bir bileşeni olarak ortaya çıkmıştır ve konakçı-mikrop iletişimine aracılık eder 3,4,5. Bu RNA izolasyon protokolünün amacı, hayvan ve insan deneklerden toplanan dışkı örneklerinden yüksek kaliteli hücre dışı RNA'yı çıkarmaktır. Protokol, ticari bir miRNA İzolasyon Kitinden uyarlandı. Elde edilen RNA, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için kullanılır. Protokol, hayvanların ve insanların dışkısında bulunan RNA'nın miktarını ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak için birkaç önemli ve yararlı ipucu içerir. RNA (mikroRNA dahil) izolasyonunun bu yöntemini geliştirmenin ve optimize etmenin nedeni, dışkıdaki mikrobiyal RNA'yı azaltmak, araştırma çalışmalarındaki değişkenleri sınırlamak ve çeşitli kafa karıştırıcı faktörleri ve kontaminasyon kaynaklarını hesaba katmadan bağırsaktaki RNA bileşimini analiz etmektir. Not olarak, bu RNA izolasyonu, RNA'nın canlı hücreden ve canlı mikroplardan (hücresel RNA) salınımını en aza indirir. Bağırsak hücreleri tarafından salınan veya gıda alımı yoluyla edinilen hücre dışı RNA'lara odaklanır. Temel olarak, bu yöntem mikrobiyal transkriptomun araştırıldığı çalışmalar için uygun değildir.

<table><tbody><tr><td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolation Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td><td>QIAGEN</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fecal (micro) rna isolation

RNA'nın bağırsak lümeninde ve hayvanlarda ve insanlarda dışkıda var olduğu netleşiyor. Aşağıda açıklanan protokol, mikroRNA'lar da dahil olmak üzere toplam RNA'yı hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden izole eder. Amaç, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için toplam RNA'yı yüksek saflık ve miktarda izole etmektir. Bu optimize edilmiş protokolün miRNA izolasyonundaki avantajları, yüksek oranda saflaştırılmış RNA ürünlerini tarif edilen ek yıkama adımlarıyla izole etme yetenekleri, numunenin yeniden süspansiyonunda geliştirilmiş bir yöntemle elde edilen RNA miktarının artması ve önemli dekontaminasyon ipuçlarıdır. Bir sınırlama, 200 mg'dan daha büyük numunenin işlenememesi ve saflaştırılamamasıdır, çünkü bu numune büyüklükleri interfazın net oluşumunda bir zorluğa neden olacaktır. Sonuç olarak, büyük örneklem büyüklüğü, protokolde açıklandığı gibi ekstrakte edilecek sulu fazı, sonunda izole edilen RNA'nın kalitesini etkileyen organik maddelerle kirletebilir. Bununla birlikte, 200 mg'a kadar bir numuneden RNA izolatları, aşağı akış analizlerinin çoğu için yeterlidir.

Temsili RNA'lar sırasıyla 50 mg fare dışkı örneğinden (2 fare dışkı peleti) ve 100 mg insan dışkısı örneklerinden izole edildi ve 50 μL nükleaz içermeyen suda salındı. Konsantrasyonun spektrofotometre analizi, sırasıyla toplam 49 μg ve 16 μg RNA miktarının izole edildiğini göstermektedir (Tablo 1). RNA saflığı, ~2.0'lık bir A260 / A280 oranı ve ~ 1.8'lik bir A260 / A230 oranı ile gösterildiği gibi yüksekti (Tablo 1). Bildirilen3</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Fecal micro RNA Isolation

Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.

Fekal (mikro) RNA İzolasyonu

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

Fecal (micro) RNA Isolation

Diagnostic and Radiological Studies of the GI System

SCIENTISTS IN ACTION

4.7K Görüntüleme.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.

Video: Fecal micro RNA Isolation

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Biyokimya

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

Gerçek zamanlı PCR ile Kıyı tortulları ve Niceleme 16S rRNA Genler ve Transkriptler eşzamanlı DNA-RNA Ekstraksiyon

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Çevre

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Kuş FTA Kartları İnfluenza Sürveyans: Alan Yöntemleri, Biyogüvenlik ve Ulaşım Sorunları çözüldü

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of hospitalizations in children with a public health impact similar to that of Rotavirus. NoVs are RNA viruses of great genetic diversity and there is a continuous appearance of new strains. Five genogroups are recognized; GI and GII with their many genotypes and subtypes being the most important for human infection. However, the diagnosis of these two genotypes remains problematic, delaying diagnosis and treatment. 1, 2, 3
For RNA extraction from stool specimens the most commonly used method is the QIAmp Viral RNA commercial kit from Qiagen. This method combines the binding properties of a silica gel membrane, buffers that control RNases and provide optimum binding of the RNA to the column together with the speed of microspin. This method is simple, fast and reliable and is carried out in a few steps that are detailed in the description provided by the manufacturer. 
 Norovirus is second only to rotavirus as the most common cause of diarrhea. Norovirus diagnosis should be available in all studies on pathogenesis of diarrhea as well as in outbreaks or individual diarrhea cases. At present however norovirus diagnosis is restricted to only a few centers due to the lack of simple methods of diagnosis. This delays diagnosis and treatment 1, 2, 3. In addition, due to costs and regulated transportation of corrosive buffers within and between countries use of these manufactured kits poses logistical problems. As a result, in this protocol we describe an alternative, economic, in-house method which is based on the original Boom et al. method4 which uses the nucleic acid binding properties of silica particles together with the anti-nuclease properties of guanidinium thiocyanate.
For the detection and genogrouping (GI and GII) of NoVs isolates from stool specimens, several RT-PCR protocols utilizing different targets have been developed. The consensus is that an RT-PCR using TaqMan chemistry would be the best molecular technique for diagnosis, because it combines high sensitivity, specificity and reproducibility with high throughput and ease of use. Here we describe an assay targeting the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region; the most conserved region of the NoV genome and hence most suitable for diagnosis. For further genetic analysis a conventional RT-PCR that targets the highly variable N-terminal-shell from the major protein of the capsid (Region C) using primers originally described by Kojima et al. 5 is detailed. Sequencing of the PCR product from the conventional PCR enables the differentiation of genotypes belonging to the GI and GII genogroups.

A One-Step RT-PCR assay for detection and genogroup identification of Norovirus isolates from children&#x2019;s stools, that utilizes primers and TaqMan probes specific to the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region, the most conserved region of the Norovirus genome is described. A non-commercial, cost-effective RNA extraction method is detailed.

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Tıp

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Biyoloji

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

Sivrisinek Gut Metagenomic RNA-seq Ribozomal RNA tükenmesi

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...