Name: fecal (micro) rna isolation
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Harvard Tıp Fakültesi'ndeki Biyopolimerler Tesisi'nden biyoanalizör için teknik yardım aldık. Bu çalışma Ulusal Multipl Skleroz Derneği araştırma hibesi RG-1707-28516 (H.L.W. ve S.L.) tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan araştırma hayvanlarını içeren tüm yöntemler, Harvard Tıp Fakültesi Brigham ve Kadın Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
Burada açıklanan insan araştırma konularını içeren tüm yöntemler, Ortaklar İnsan Araştırma Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur.
1. Fekal numune toplama
<ol><li>Bir deneydeki her hayvan deneği için vidalı kapaklı steril ve nükleaz içermeyen 2 mL mikrosantrifüj tüpünü otoklav yapın veya hazırlayın.<ol><li>İnsan denekler için, her denek için uygun, nükleaz içermeyen ve steril bir dışkı örneği toplama cihazı sağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Her hayvan deneklerinden 25-100 mg (fare dışkı örnekleri için yaklaşık 1-4 dışkı peleti) dışkı örneğini steril bir ortamda toplayın. NOT: En yüksek saflıkta RNA elde etmek için iki veya daha fazla dışkı peleti (~ 50 mg veya daha ağır) tercih edilir.<ol><li>Gerekli tüm Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) ve malzemeleri kullanın, örneğin: dışkı numunesi kontaminasyonunu önlemek için hayvan araştırma konusunun yerleştirildiği çalışma alanını sterilize etmek için bir çift laboratuvar eldiveni, bir dezenfektan spreyi ve steril bir kağıt havlu.<ol><li>İnsan denekler için, her araştırma deneğine / toplayıcıya mümkün olduğunca steril bir ortamda 100-200 mg dışkı örneği toplamasını söyleyin. Standart steril çalışma kullanın ve dışkı numunesi kontaminasyonundan kaçının.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Kontaminasyonu önlemek için her bir hayvan deneklerinden dışkı numunelerini, diğer yüzeylere dokunmadan vidalı kapaklı 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne doğrudan toplayın.<ol><li>İnsan denekler için, kontaminasyonu önlemek için her bir deneğe doğrudan sağlanan uygulanabilir bir toplama cihazına (örneğin, steril bir dışkı numunesi toplama kiti) dışkılama talimatı verin. NOT: Tuvalet yüzeyleri, su, idrar veya diğer steril olmayan yüzeyler/nesneler tarafından kontaminasyondan kaçınılması için konuya talimat verin.</li>
	</ol></li>
	<li>2 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplanan dışkı örneklerini hemen -80 ° C'de dondurun veya aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi dışkı yeniden süspansiyonundan önce RNA'nın daha iyi miktarı ve kalitesi için bir kova kuru buz içine yerleştirin.<ol><li>İnsan dışkı örnekleri için, 200 mg'lık her taze numuneyi vidalı kapaklarla 2 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve dışkı aşağıda açıklandığı gibi yeniden süspansiyondan önce -80 ° C'de dondurun.<ol><li>Vidalı kapaklı 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde olmayan dışkı örneklerinin depolanması için, dondurulmuş numunelerin her birini tartın ve aşağıda açıklandığı gibi dışkı yeniden süspansiyonundan önce vidalı kapaklı ayrı 2 mL mikrosantrifüj tüplerine 100-200 mg aktarın. NOT: İnsan dışkı örnekleri için, RNA izolasyonu için 200 mg'dan fazla dışkı örneği almaktan kaçının, çünkü aşağıdaki adımlarda zorluklara neden olabilir. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde aşırı yüklenmiş bir numune ile, sulu faz, organik faz ve interfaz net bir şekilde oluşturulamayabilir ve ayrılamayabilir. Prosedür burada duraklatılabilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Yıkama çözeltilerinin hazırlanması
<ol><li>Şişede gösterildiği gibi 30 mL'lik son hacme ulaşmak için miRNA İzolasyon Kitinde sağlanan Yıkama Çözeltisi 1'e 21 mL Amerikan Kimya Derneği (ACS) dereceli% 100 etanol ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Her şey şişede çözülene kadar vorteks.</li>
	<li>Şişede gösterildiği gibi 50 mL'lik son hacme ulaşması sağlanan Yıkama Çözeltisi 2/3'e 40 mL ACS kaliteli% 100 etanol ekleyin. 5 s boyunca veya son karışım iyice harmanlanana kadar vorteks.</li>
</ol>3. Ekipman ve malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Çalışma alanını ve ekipmanı, örneğin: laboratuvar tezgahına, kimyasal duman davlumbazındaki çalışma alanına ve mikro santrifüj tüp raflarına, bir Ribonükleaz (RNase) dekontaminasyon çözeltisi (örneğin, ticari olarak temin edilebilen RNaz dekontaminasyon çözeltisi) ile püskürtün. Kontaminasyonu önlemek için, RNase dekontaminasyon çözeltisi ile gerekli görülen her yerde ve her zaman yüzeylere uygulayın.</li>
	<li>Temiz bir laboratuvar önlüğü giyin, yüz maskesi takın ve dışkı örneklerindeki RNA'yı insan derisinde bulunan nükleazlardan korumak için uygun laboratuvar eldivenleri giyin. Eldivenleri RNase dekontaminasyon çözeltisi ile püskürtün ve kontaminasyonu önlemek için eldivenleri sık sık değiştirin.</li>
	<li>Dışkı yeniden süspansiyonundan önce çözülmeyi önlemek için -80 ° C'de depolanan dışkı örnekleri için bir kova kuru buz ve malzemeler için bir kova buz hazırlayın, örneğin: Asit-Fenol: Kloroform, raf ömrünü uzatmak için. NOT: Protokolde kullanılan ortam da dahil olmak üzere malzemelerin nükleazların kontaminasyonu olmadan steril olduğundan emin olun.</li>
</ol>4. Dışkı süspansiyonu
<ol><li>600 μL steril 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) 25-100 mg dışkı örneğini yeniden askıya alın. DİKKAT: Dışkı örnekleri, numunedeki hücreler çözüldüğünde buz kristalleri hem iç hem de dış hücresel bölmeleri yırttığından, RNazların ve hücresel RNA'nın salınımını en aza indirmek için kısmi çözülme bile olmadan -80 ° C'den çözüldüğünde derhal işlenmelidir.<ol><li>Oda sıcaklığında (RT) dışkı örnekleri içeren vidalı kapaklı 2 mL mikrosantrifüj tüpüne 600 μL 1x DPBS ekleyin.</li>
		<li>RT'de 30 dakika boyunca kapatılmış 2 mL mikrosantrifüj tüpünde 600 μL 1x DPBS'ye batırılmış dışkı örneklerinin karışımını inkübe edin.</li>
		<li>1 mL pipet ucu ve vorteks kuyusu ile ezerek karışımı 2 mL mikrosantrifüj tüpü kapatılmış olarak yeniden askıya alın. RNA'nın miktarını ve kalitesini optimize etmek ve arttırmak için, karışımı S4000 (veya 4000 rpm) ve 45 s'de bir döngü ayarına sahip bir homojenizatör ile yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Organik ekstraksiyon
DİKKAT: Tehlikeli kimyasal duman başlığını asit-fenol kullanımı ile Adım 6'ya kadar aşağıdaki adımlar için kullanın: kloroform ve ACS sınıfı% 100 etanol, toksisiteleri ve yanıcılıkları nedeniyle. KKD'yi gerektiği gibi değiştirin ve tehlikeli maddelerle çalışırken uygun standart önlemleri alın.
<ol><li>RNA'yı 600 μL asit-fenol ile ekstrakte edin: kloroform (gerekli asit-fenol hacmi: gerekli kloroform, Adım 4.1'de eklenen 1x DPBS'nin başlangıç hacmine eşittir).<ol><li>Adım 4.1'den itibaren süspansiyona 600 μL asit-fenol ekleyin: kloroform. NOT: Asit-fenol çekin: üst faz sulu bir tamponla karıştırıldığı için şişedeki alt fazdan kloroform. Bu iki faz arasındaki interfaz bozulursa, asit-fenol'ü bekleyin ve geri çekin: kloroform, yalnızca interfaz kontaminasyonu önlemek için kendini yeniden kurduğunda.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorteks karışımı 60 s iyice karıştırmak için. Alternatif olarak, verimdeki RNA miktarını optimize etmek ve arttırmak için, S4000 ve 45 s'de bir döngü ayarına sahip bir homojenizatör kullanarak karıştırın.</li>
	<li>Sulu ve organik fazları bir mikrosantrifüj ile ayırmak için RT'de 10.000 x g'da 15 dakika santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, interfaz kompakt olmalıdır. Değilse, santrifüjlemeyi tekrarlayın. NOT: Eğer interfaz, başlangıç hacminin eklenen asit-fenol hacmine eşit olmayan oranı nedeniyle istenildiği kadar kompakt olamıyorsa: birkaç santrifüjleme tekrarından sonra kloroform, kontaminasyonu önlemek için sulu fazı daha dikkatli bir şekilde geri kazanmaya devam edin.</li>
	<li>Sulu fazı geri kazanın ve menteşe kapaklı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (miRNA izolasyon kiti tarafından sağlanmaz).<ol><li>Sulu (veya üst) fazı, alt fazı rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın ve menteşe kapaklı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aktarılan hacme dikkat edin (örneğin, ~500 μL). NOT: İnterfaz kompakt olduğunda ve üst faz açıkça ayrıldığında, muhtemelen sulu fazın üstünde yüzen birkaç küçük artık parçacık vardır. Bu kalıntıları önlemek için pipeti dikkatli bir şekilde kullanın ve sulu fazın sadece küçük bir hacmini elde edebilseniz bile, kaliteli bir RNA verimi sağlamak için sadece gözle görülür ve net bir şekilde ayrılmış sulu fazı geri kazanın.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Son RNA izolasyonu
<ol><li>2 mL mikrosantrifüj tüpündeki sulu faza 1.25 hacim RT ACS dereceli% 100 etanol ekleyin (örneğin, Adım 5.4'ten 500 μL sulu faz geri kazanılırsa 625 μL% 100 etanol ekleyin). Vorteks 3 s.</li>
	<li>Sulu faz/etanol karışımını miRNA izolasyon kitinde verilen filtre kartuşundan yükleyin.<ol><li>Her numune için, filtre kartuşunu kit tarafından sağlanan toplama tüplerinden birine yerleştirin.<ol><li>Pipet ve sulu faz/etanol karışımının 600 μL'sini filtre kartuşuna yükleyin. NOT: Pipetlemeden önce etanolün sulu faz ile iyice karıştırılması için karışımı kısa bir süre vortekse edin. Bir seferde sulu faz/etanol karışımının en fazla 700 μL'si yüklenemez.</li>
		</ol></li>
		<li>Karışımın içinden filtrelemek için 90 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Daha yüksek hızda eğirmek filtreye zarar verebilir.</li>
		<li>Filtratın ve birbirini izleyen uygulamalarda tüm karışım aynı filtre membranından filtrelenene kadar Adım 6.2.1 ila 6.2.2'yi tekrarlayın. Aşağıdaki yıkama adımları için aynı toplama tüpünü saklayın ve tekrar kullanın.</li>
		<li>Filtreyi 700 μL miRNA Yıkama Çözeltisi 1 ile yıkayın. DİKKAT: miRNA Yıkama Çözeltisi 1, cilt tahrişine ve ciddi göz hasarına neden olabilecek guanidin tiyosiyanat içerir. Gerekli KKD'leri giyin, örneğin: eldivenler, yüz siperliği, koruyucu laboratuvar önlüğü. Gerektiğinde eldivenleri sık sık değiştirin.<ol><li>ACS sınıfı% 100 etanol ile hazırlanan çalışma çözeltisi olan 700 μL miRNA Yıkama Çözeltisi 1'i filtre kartuşuna uygulayın.</li>
			<li>miRNA Yıkama Çözeltisi 1'i filtre kartuşundan filtrelemek için 60 sn'lik santrifüj.</li>
			<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Filtreyi her biri 700 μL, 500 μL ve 250 μL hacimlerde art arda 2/3 Yıkama Çözeltisi ile yıkayın.<ol><li>ACS sınıfı %100 etanol ile hazırlanan çalışma çözeltisi olan 700 μL Yıkama Çözeltisi 2/3'ü filtre kartuşuna uygulayın.<ol><li>1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.</li>
				<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.</li>
			</ol></li>
			<li>Filtre kartuşuna 500 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 uygulayın.<ol><li>1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.</li>
				<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.</li>
			</ol></li>
			<li>Filtre kartuşuna 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 uygulayın.<ol><li>1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.</li>
				<li>Filtrasyonu toplama tüpünden atın.</li>
			</ol></li>
			<li>Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve artık sıvıyı filtreden çıkarmak için tertibatı 5 dakika boyunca döndürün.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. 50 μL nükleaz içermeyen su ile Elute RNA
<ol><li>Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Pipetle 50 μL nükleaz içermeyen suyu filtrenin ortasına yerleştirin ve toplama tüpünü kapatın.<ol><li>RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>RNA'yı yeni toplama tüpüne geri kazandırmak için 8.000 x g'de 5 dakika boyunca döndürün.</li>
		<li>Bir florometre kullanarak geri kazanılan dışkı RNA'sının konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. Geri kazanılan fekal RNA -80 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Yazarlar, bu protokol makalesinde açıklanan araştırma yöntemiyle ilgili veya maddi hiçbir finansal çıkar beyan etmemektedir.

İzolasyon sırasında RNaz kontaminasyonunu önlemek için RNase içermeyen tekniğin kullanılması önemlidir7. Santrifüjleme ve kompakt bir interfazın oluşumundan sonra, sulu fazı geri kazanırken interfaz, alt faz ve sulu fazın üstünde yüzen partikül kirleticisinden kaçınmak önemlidir. Ek olarak, optimize edilmiş kalite için filtre membranındaki kirleticileri ortadan kaldırmak üzere 500 μL ve 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 ile iki yıkama adımı eklenir. Ayrıca, 200 mg'da...

Hücre dışı RNA, birçok biyolojik sürece aracılık eden önemli bir faktör olarak kabul edilmektedir1. Dışkıda hücre dışı RNA ilk olarak 2008 yılında kolon kanseri ve aktif ülseratif kolit2 için bir belirteç olarak bildirilmiştir ve yakın zamanda bağırsak lümeninin ve dışkının normal bir bileşeni olarak ortaya çıkmıştır ve konakçı-mikrop iletişimine aracılık eder 3,4,5. Bu RNA izolasyon protokolünün amacı, hayvan ve insan deneklerden toplanan dışkı örneklerinden yüksek kaliteli hücre dışı RNA'yı çıkarmaktır. Protokol, ticari bir miRNA İzolasyon Kitinden uyarlandı. Elde edilen RNA, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için kullanılır. Protokol, hayvanların ve insanların dışkısında bulunan RNA'nın miktarını ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak için birkaç önemli ve yararlı ipucu içerir. RNA (mikroRNA dahil) izolasyonunun bu yöntemini geliştirmenin ve optimize etmenin nedeni, dışkıdaki mikrobiyal RNA'yı azaltmak, araştırma çalışmalarındaki değişkenleri sınırlamak ve çeşitli kafa karıştırıcı faktörleri ve kontaminasyon kaynaklarını hesaba katmadan bağırsaktaki RNA bileşimini analiz etmektir. Not olarak, bu RNA izolasyonu, RNA'nın canlı hücreden ve canlı mikroplardan (hücresel RNA) salınımını en aza indirir. Bağırsak hücreleri tarafından salınan veya gıda alımı yoluyla edinilen hücre dışı RNA'lara odaklanır. Temel olarak, bu yöntem mikrobiyal transkriptomun araştırıldığı çalışmalar için uygun değildir.

<table><tbody><tr><td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolation Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td><td>QIAGEN</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fecal (micro) rna isolation

RNA'nın bağırsak lümeninde ve hayvanlarda ve insanlarda dışkıda var olduğu netleşiyor. Aşağıda açıklanan protokol, mikroRNA'lar da dahil olmak üzere toplam RNA'yı hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden izole eder. Amaç, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için toplam RNA'yı yüksek saflık ve miktarda izole etmektir. Bu optimize edilmiş protokolün miRNA izolasyonundaki avantajları, yüksek oranda saflaştırılmış RNA ürünlerini tarif edilen ek yıkama adımlarıyla izole etme yetenekleri, numunenin yeniden süspansiyonunda geliştirilmiş bir yöntemle elde edilen RNA miktarının artması ve önemli dekontaminasyon ipuçlarıdır. Bir sınırlama, 200 mg'dan daha büyük numunenin işlenememesi ve saflaştırılamamasıdır, çünkü bu numune büyüklükleri interfazın net oluşumunda bir zorluğa neden olacaktır. Sonuç olarak, büyük örneklem büyüklüğü, protokolde açıklandığı gibi ekstrakte edilecek sulu fazı, sonunda izole edilen RNA'nın kalitesini etkileyen organik maddelerle kirletebilir. Bununla birlikte, 200 mg'a kadar bir numuneden RNA izolatları, aşağı akış analizlerinin çoğu için yeterlidir.

Temsili RNA'lar sırasıyla 50 mg fare dışkı örneğinden (2 fare dışkı peleti) ve 100 mg insan dışkısı örneklerinden izole edildi ve 50 μL nükleaz içermeyen suda salındı. Konsantrasyonun spektrofotometre analizi, sırasıyla toplam 49 μg ve 16 μg RNA miktarının izole edildiğini göstermektedir (Tablo 1). RNA saflığı, ~2.0'lık bir A260 / A280 oranı ve ~ 1.8'lik bir A260 / A230 oranı ile gösterildiği gibi yüksekti (Tablo 1). Bildirilen3</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Fecal micro RNA Isolation

Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.

Fekal (mikro) RNA İzolasyonu

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

Fecal (micro) RNA Isolation

Diagnostic and Radiological Studies of the GI System

SCIENTISTS IN ACTION

4.6K Görüntüleme.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.

Video: Fecal micro RNA Isolation

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetik

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Tıp

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Biyomühendislik

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Biyoloji

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...