Bu yöntem, gün ışığı görüşü için gerekli olan koni reseptörlerini incelemek için kullanılır. Yöntemlerin avantajı, kolay erişilebilir ve birincil koni kültürlerinin tek kaynağı olan döllenmiş tavuk yumurtası kullanmasıdır. Protokol, kalıtsal retina dejenerasyonu için gelecek vaat eden bir tedavi olan Çubuk Türetilmiş Koni Canlılık Faktörü'nü tanımlamak için kullanıldı.
Ayrıca, protokol koni fotoreceptör metabolizmasını incelemek için kullanılmıştır. Açıklanan protokole dikkatle uyarak, uzmanlığı birincil hücre kültüründe olan bir birey, sadece birkaç denemeden sonra koni zenginleştirilmiş kültür elde edebilmelidir. Endüstriyel bir kuluçkahaneden haftalık döllenmiş yumurta toplayarak başlayın.
Döllenmiş yumurtaları laboratuvarda 17 santigrat derecede koruyun. Her kültür için, yedi döllenmiş yumurtayı 20 santigrat derecede 24 saat ve daha sonra 37 santigrat derecede 136 saat, eğimin aralıklı olarak geri çevrilmesi ile nemli bir odada kuluçkaya yatırın. Tavuk embriyolarını kurtarmak için, yumurtaların yüzeyini dezenfektanla yıkayın, kabuğun üst kısmında büyük düz pense ile bir delik açarak yumurta kabuğunu kırın, ardından şapkayı yumurtadan çıkarmak için kabuğu kesin.
Her embriyoyu kavisli önps ile yumurta kabuğundan yavaşça çıkarın ve daha önce 37 santigrat dereceye ısıtılmış steril PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Embriyoları çevreleyen zarfı dikkatlice çıkarın. Hamburger ve Hamilton ile görsel karşılaştırma yaparak her embriyonun gelişim aşamasını doğrulayın ve gelişimin 29.
Karbondioksitsiz ortamda çalışarak, kornea aşağı bakacak şekilde dört göz ve deneyciye bakan optik siniri konumlandırın. İki düz emiş kullanarak optik sinirde bir delik açın. Retina ve pigment epitel arasına her bir epanstan bir dal yerleştirin, ardından epiteli retinadan ayırmak için gözü çekin ve döndürün.
Korneayı çıkarın, ardından lensi ve vitreus. Dört retinayı pH 7.2'de Ringer'ın ortasını içeren bir Petri kabına aktarın. dört retinayı iki düz pense kullanarak çok küçük parçalara bölün ve parçaları Ringer'ın ortamıyla iki kez yıkayın.
İkinci yıkamadan sonra, retina parçalarının tüpün dibine düşmesine izin verin ve ortamı çıkarın. Retina parçalarını 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca bir Trypsin çözeltisi ile tedavi edin. 20 dakika sonra, %10 inaktive fetal baldır serumu ile desteklenmiş kültür medyası ekleyerek reaksiyonu durdurun.
Hücre süspansiyonu 0.05 mg DNase 1 ile kuluçkaya yaslanın, ardından bir pipetle yukarı ve aşağı pipetle aşağı yukarı pipetle hücre kümelerini ve DNA'yı hemen ayırın. Retina hücre süspansiyonu kimyasal olarak tanımlanmış kültür ortamı veya CDM ile iki kez yıkayın. Şeffaf tabanlı iki siyah 96 kuyulu kültür plakalarını 37 santigrat derecede iki saat boyunca polilizin ile tedavi edin.
Bittiğinde, plakaları M199 kültür ortamı ile iki kez durulayın. Canlı hücreleri lekelamak için hücre süspansiyonunun 10 mikrolitrelik bir aliquot'una Trypan mavisi ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyon örneğini bir hemositometreye ekleyin.
Hücreleri saydıktan sonra, hücre süspansiyonu CDM kullanarak uygun konsantrasyonlara getirin. Önceden tanımlanmış bir desen kullanılarak taranacak molekül kitaplığının 50 mikrolitresini ekleyin. İki hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini önceden işlemden geçmiş iki siyah 96 kuyu kültür plakasına tohumlayın.
Plakalardaki hücreleri, plakanın sağından sola doğru çok kanallı bir pipetle dağıtın ve her sütun arasında homojenleşin. Daha sonra plakaları yedi gün boyunca 37 santigrat derecede, % 5 karbondioksitin altında, ortam değişikliği olmadan kuluçkaya yatırın. Uygulanabilir hücreleri saymak için, plakanın her kuyusuna 2,7 mikromoler kalsein ve 0,3 milimoler ethidyum homodimer ekleyin.
Işık yokluğunda tabakları oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. 485 ve 520 nanometrede iki ekscitasyon filtresi, 520 ve 635 nanometrede iki emisyon filtresi ve şarj bağlantılı bir cihaz kamerası ile donatılmış ters mikroskopla donatılmış bir ters mikroskop içeren otomatik bir plaka okuyucusunda floresan okuyun. Bu protokol, sekiz haftalık Long-Evans Rats'in 400 gözünden koroid ve retina pigmentli epitelden yapılmış normalleştirilmiş bir cDNA kütüphanesini taramak için kullanıldı.
211, 200 bireysel klona karşılık gelen toplam 2.112 set 100 klon değerlendirildi. İkiden büyük oranlı 42 klon havuzu arasında, 0080 ve 0073 havuzları, yedi günlük kültürden sonra negatif kontrolden 16 ve 14 kat daha yüksek bir canlılık oranına sahipti. Seçilen 100 klondan her biri gliserol stoklarından 16 set 10 klona bölündü.
0073-09 alt havuzu en güçlü canlılık oranını verdi ve koni ile zenginleştirilmiş kültürler üzerinde üçüncü turda test edilen 16 bireysel klon üretmek için alt bölümlere ayrıldı. 0073-09-37 klonu 2,5 canlılık oranıyla dikkat çekti. Daha fazla analiz, bu klonlamanın koni sağkalımında sağlam ve tekrarlanabilir bir etkiye sahip olduğunu doğruladı.
Test bağımsız olarak tekrarlandı ve 1.8 kilobases ekleme sıralandı. Biyoinformatik bir analiz, Epitel Türevi Koni Canlılık Faktörü olarak adlandırılan 0073-09-37 klonunu veya EdCVF'nin üç açık okuma çerçevesi içerdiğini ortaya koydu. Bağımsız olarak test edildiğinde, sadece ORF1 koniler üzerinde koruyucu bir etki uyguladı.
ORF1 glutatyon S-transferaz proteini olarak üretildi. Epitel türevi koni canlılık faktörü saflaştırıldı ve GST etiketi kaldırıldı. Trofik aktivitenin analizi, EdCVF'nin koni ile zenginleştirilmiş kültür sisteminde koni dejenerasyonunu önleyebildiğini göstermiştir.
Bu prosedürü denerken, koni ile zenginleştirilmiş kültürleri elde etmek için embriyoların gelişim aşaması dikkatlice kontrol edilmelidir. Bu protokolden sonra, hücreler RdCVF gibi herhangi bir sağkalım faktörünün moleküler mekanizmalarını incelemek için plazmid DNA ile elektropore edilebilir. Bu teknik, koni sağkalımının matematiksel modellerinin geliştirilmesi de dahil olmak üzere metabolik araştırmaların önünü açmaktadır.
