Burada açıklanan yöntemler, operasyonel olarak deniz lipitleri olarak tanımlanabilen bileşiklerle ilgilidir. Bu tanımın temeli, kutupsal olmayan organik çözücülerde sıvı-sıvı ekstraksiyonuna uygun olmalarıdır, bu da onları sulu bir matristeki diğer bileşiklerden ayırmak için uygun bir araç sağlar. Hidrofobik doğaları, deniz suyundan veya biyolojik örneklerden izole edilmelerini, zenginleşmelerini ve tuz ve proteinlerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır.
Deniz suyu numuneleri için, ilk adım normalde genellikle filtrasyon yoluyla operasyonel olarak tanımlanmış çözünmüş ve partikül fraksiyonlarına ayrılmayı içerir. Partikül fraksiyonu filtreler tarafından tutulandır ve pore boyutu kesmeyi tanımlamada önemlidir. Lipid temizli tokalar kullanarak, lipid temiz filtrasyon sistemi üzerine küllenmiş 47 milimetrelik bir cam elyaf filtresi yerleştirin.
Örneği alın ve yerleşmiş olabilecek parçacıkları yeniden canlı hale getirmek için hafifçe döndürün. Bilinen bir birimi ölçün. Hacim, numunedeki partikül malzeme miktarına bağlı olacaktır.
Hacim ölçüldüğünde, filtrasyon sistemine emme ekleyin ve filtreyi filtrelenmiş deniz suyu ile hafifçe ıslatın. Numunenin tamamını filtrasyon hunisine yavaşça ekleyin ve tüm parçacıkların filtreye eklenmesini sağlamak için dereceli silindiri deniz suyuyla durulayın. Tüm parçacıkların filtreye durulanmasını sağlamak için cihazın hunisini durulayın.
Tüm sıvıyı filtreden çekin, ancak filtredeki hücreleri yırtabileceğinden filtrenin kurumasına izin vermeyin. Lipid temizlemiş toksları alın, filtreyi ikiye katlayın, sonra bir kez daha üçte bir ve sonra yarı uzunlamasına katlayın. Filtre daha sonra lipid temiz bir şişeye yerleştirilir.
Filtreyi iki ml kloroformla örtün, azot altında kapak ve Teflon bantla kapatın. Bu noktada, numune bir yıla kadar eksi 20 Santigrat derece depolama alanında kararlı olacaktır. Numune hazırlanıyor.
Filtratların bilinen bir hacmini lipid temiz cam mezunu bir silindire ölçün. Numuneyi lipid temizliğinde bir ayırıcı huninin içine yerleştirin ve yaklaşık 20 ml kloroform ekleyin. Bu karışımı sık sık havalandırmak için en az iki dakika sallayın.
İlk ayırmadan sonra, ilk özün çıkarılması ve asit eklenmesi. Çözeltiyi iki dakika salladıktan sonra, huniyi alüminyum folyoya sarın ve yaklaşık beş dakika ayırma gerçekleşene kadar bekleyin. Ayırmayı bekledikten sonra, iki katmanı görmek için alüminyum folyonun altını soyun.
Alt katmanı lipid temizlenerek yuvarlak alt şişeye toplayın, üst tabakanın hiçbirini içermemeye dikkat edin. Yuvarlak alt şişeyi azot altına kapla ve bir dondurucuya yerleştirin. Ayırıcı huniyi geri kazan ve sıvıya sülfürik asit ekleyin.
Mevcut her litre deniz suyu için 0,25 mls ekleyin. Sülfürik asit eklendikten sonra, deniz suyunu hafifçe çalkalayın, ardından 10 ml daha kloroform ekleyin ve iki dakika daha havalandırma yaparken kuvvetlice çalkalayın. O zaman ayrılığa izin ver.
İkinci ve üçüncü ayrılıklar. Alt tabakayı su dahil etmeden tekrar yuvarlak alt şişeye ekleyin. Üçüncü bir miktar 10 ml kloroform ekleyin ve havalandırma ile iki dakika daha çalkalayın.
Ayırmadan sonra, kloroformun son kısmını aynı şişeye yerleştirin ve kombine özler döner evaporatör tarafından buharlaştırılabilir ve iki ml'lik bir şişeye aktarılabilir. Kurulum. Ekstraksiyon kurulumu için buzla dolu yalıtımlı bir kaba ihtiyacınız olacak. Çözücüler kloroform, kloroform eklenmiş su ve 2:1 kloroform-metanol içerir.
Bu çözeltiden, örnek başına yaklaşık bir ml'ye ihtiyacınız vardır, bu yüzden buna göre yapın. Tüm bu çözücüler, ekstraksiyonlar başladığında üşümeleri için buza yerleştirilmelidir. Numuneler de buzun üzerine çıkıyor, böylece her şey soğuk kalıyor.
Taşlama ve çıkarma. Numuneler iki ml kloroformda dondurulmuş olarak depolanmıştır, bu nedenle bir ml buz gibi metanol veya yarım pipetful ekleyin. Kaval ile şişeye dokunmamak için metanol eklerken dikkatli olun.
Metanol ile üç kez ve kloroform ile üç kez temizleyin ve homojenize edin. Taşlama yaparken, şişeyi kırmanız durumunda elinizdeki ekstraksiyon şişesini kesmemeye ve numunenin ısınmasını önlemeye dikkat edin. Çabuk öğütün.
Numune tamamen öğütüldükten sonra, buzda bekletin ve öğütücüden kalan parçacıkları 2:1 kloroform-metanol ml kullanarak şişeye geri yıkayın. Gerekirse, yıkamadan önce parçacıkları şişeye geri zorlamak için lipid temizlemeli bir tokmak seti kullanın. Pipet öğütücüye veya öğütücüye şişeye dokunmamaya dikkat edin.
Daha sonra öğütücüye veya öğütücüye dokunmadan 0,5 mls veya çeyrek pipet kloroform çıkarılmış su ekleyin. Öğütücü yıkandığında, öğütücüden şişeye asılı damlaya dokunun. Şapkayı tak ve sonicate hazır olana kadar buzda tut.
Çift pipetleme. Santrifüjlemeden sonra, şişede iki katman olacaktır: organik ve sulu katmanlar. Organik tabakayı elde etmek için çift pipetleme tekniği kullanılır.
Bunu yapmak için, ampul gevşek bir şekilde konmuş beş santimetrelik kısa bir pipet işaret parmağı ile orta parmak arasında kavranır. Ampulü sıkarken pipeti iki katmandan hafifçe aşağı itin ve kabarcıkların sonuna kadar çıkmasına neden olur. İkinci katmanın altına ulaşıldığında, organik tabakayı pipete çekmeden ampulü çıkarmak için başparmağınızı kullanın.
Dokuz santimetrelik bir pipetle ampulü tamamen sıkın. Pipet uzun ucunun beş santimetrelik pipete koyun ve alt tabakayı beş santimetrelik pipetten çıkarın. Bu ekstrakt daha sonra lipid temiz bir şişeye yerleştirilir.
Hepsi kaldırılana kadar alt katmanı çıkarmaya devam edin. Lipid temiz şişesinde birikmiş tüm katmanlar. Pipetleri yıkamak.
Ampulü dokuz santimetrelik pipetten çıkarın. Özü içinde olan şişeye yerleştirin. Bir pipet dolusu temiz kloroform alın ve pipet yıkanan tırnağı dokunmadan, kloroformu pipet içinin etrafına fışkırtın.
Yıkarken boruyu yavaşça çevirin. İkinci bir pipet dolusu kloroform alın ve aynı şeyi pipet dışına yapın. Tüm kloroformun pipetten aşağı ve ekstraksiyon şişesine akmasını sağlamak için.
Uzun pipetle bitirdiğinizde, kısa olanı alın ve tekrarlayın, ancak bunu numuneyle şişeye yıkayın. Bir örnek tespit etmek. Bir şırındını kloroformla temizleyin.
Bilinen hacmin bir örneğini alın ve şırınnayı numunede durulayın. Örneği tespit etmek istediğiniz miktarın ötesine çekin. Ardından pistonu hava kabarcığı olmamasını sağlamak istediğiniz miktara getirin.
0,5 mikrolitre dağıtmak ve damlayı çubuğa dokunmak için düğmeyi kullanın. Bir sonraki damlayı aynı noktaya yerleştirmeden önce kurumaya bırakın. Tüm örnekleri sıcak bir sıcak plakanın ucunda tutulan çubuklar üzerinde bir çizgide tespit edin.
Asetona odaklanmak. Numunenin odaklama%100 asetonunda yapılır. Geliştirme tankının altına yaklaşık 70 ml aseton ekleyin.
İki rafı alın ve yavaşça geliştirme tankına haline haline alın. Noktanın altı noktanın üst kısmıyla birleşene kadar çözücünün ön kısmının çubuğa tırmanmasını izleyin. Çubukları çıkarın.
Yaklaşık beş saniye kurulayın, sonra prosedürü tekrarlayın. Numuneler çok konsantre ise, bu odaklama üçüncü kez yapılabilir. İlk geliştirme sistemi.
İlk geliştirme sistemi 98,5 ila 0,5 arasında heksin, etil eter ve formik asitten oluşur. Mezun bir silindiri heksan ile üç kez durulayarak ve atarak başlayın. Mezun silindiri 85 mls'in biraz ötesinde heksan ile doldurun.
Daha sonra mezun silindiri 90 mls'e doldurmak için bir pipet ve heksan şişesi kullanın. Daha sonra menisküs tabanını bir ml etil eter verecek olan etil eter kullanarak 91 ml'lik hatta getirin. Hamilton şırındını kullanarak 0,5 ml formik asit ekleyin.
Ama önce Hamilton şırındını formik asitle üç kez durulayın, böyle bir kloroformun şırınnadan numuneyi durulamak için kullanılmamasını sağlayın. Toplam 50 mikrolitre için aynı anda iki tam şırınga veya 25 mikrolitre ekleyin. Şırınnadaki metalin aşındırılmasını önlemek için formik asidin şırın otu hemen kloroformla durulaması önemlidir.
Hamilton şırınd temiz olduğunda, heksin ve pipet kullanarak çözeltiyi tam olarak 100 mls'ye kadar yapın. Sonra üç veya dört kez kaplayın ve ters çevirin. Geliştirme tankına yaklaşık 30 ml dökün.
Kağıdı ıslatmak ve tankı durulamak için bu 30 mls'yi kullanın. Durulama çözeltisini atın. Kalan 70 mls'i geliştirme tankına ekleyin.
Geliştirme sistemine raflar ekleniyor. Geliştirme sistemine çubuk eklemek her gelişme için aynıdır. Zamanlayıcının çubukların geliştirileceği süre için ayarlı olduğundan emin olun.
Ve sonra rafları alın ve yavaşça tanka diriltin. Çözücü ön örnek noktalara ulaşana kadar izleyin, ardından zamanlayıcıyı başlatın. İkinci geliştirme sistemi.
İkinci geliştirme sistemi heksin, etilen ve formik asittir, 79 ila 20 ila bir. Bu yüzden daha önce olduğu gibi, mezun silindiri heksan ile üç kez durulayın. Tam olarak 20 ml eter ve ardından hacmi 21 mls'e getiren bir ml formik asit ekleyin.
Daha sonra hacmi heksam ile 100 mls'ye getirin. Şişe pompalarını kullanarak yaklaşık 75 ml hekzan ekleyin. Ve porsiyon için bir pipet kullanın.
Birkaç kez kaplayın ve ters çevirin. Kağıdı ıslatmak ve tankı durulamak için geliştirme tankına yaklaşık 30 ml ekleyin. 30 ml'yi atın.
Kalan 70'i ekleyin ve çubuklar için hazır olsun. Üçüncü geliştirme sistemi. Üçüncü geliştirme sistemi kloroform, metanol ve kloroform eklenmiş su karışımıdır, 50, 40 ila 10.
Mezun silindiri kloroformla üç kez durulayın. Yaklaşık 45 ml kloroform ekleyin. Bir pipet kullanarak, menisküs tabanını 50 ml işaretine getirin.
Yaklaşık 38 ml metanol ekleyin. Menisküs tabanını 90 ml çizgisine getirin. Daha sonra son 10 ml'lik suyu kloroform eklenmiş su ile doldurun.
Diğer geliştirme sistemlerinde olduğu gibi, bunu üç veya dört kez ters çevirin ve ardından kağıdı ıslatmak için tanka 30 ml dökün. Bu 30 ml'yi atın ve son 70 ml'yi tanka ekleyin. Metanol hazırlanıyor.
Derivatizasyon için kullanılan Hilditch çözeltisini yapmak için, herhangi bir kloroformu çıkarmak için metanol ile fazladan üç kez kurutulmuş veya durulanmış lipid temiz temiz hacimsel şişeyi doldurun. Menisküs tabanı hizaya gelene kadar metanol ekleyin. Metanol ölçümünden sonra, 60 santigrat derecede en az 24 saat kurutulan sodyum sülfat ekleyin.
Hacim ölçüm şişesinin altını kapleyecek kadar sodyum sülfat ekleyin. Kaplandıktan sonra, iki kez ters çevirin, böylece metanoldeki herhangi bir su sodyum sülfat tarafından emilir. Ters çevirip salladıktan sonra en az beş dakika bekletin.
Asit ekleniyor. Metanol beş dakika yerleştikten sonra, tüm sodyum sülfatın hacimsel şişenin dibinde kalmasını sağlamak için yavaşça son cam şişeye deklare edin. Sodyum sülfat genellikle altta kalır, bu nedenle tüm metanol dökülmelidir.
Duman kaputunun arkasında sodyum sülfat bulunan hacimselliği kurumaya bırakın. Pipetman kullanarak metanol içine yavaşça sülfürik asit ekleyin. Metanol tükürmesin diye bir seferde birkaç damla ekleyin.
Tüm asit eklendikten sonra, kapak ve karıştırmak için hafifçe karıştırın. Çözüm artık türev ürünler için kullanılmaya hazırdır, ancak haftalık olarak yapılmalıdır. Türevleri yapmak.
Hacmi bilinen bir miktara getirmiş bir özü şişesinden, döndürün, ardından özün bir kısmını lipid temiz, işaretli 15 ml'lik şişeye çıkarın. Çıkardığınız miktar, Iatroscan'dan alınan numunenin konsantrasyonuna göre belirlenecektir. Örneği çıkarmak için lipid temiz drummond pipet kullanın.
Numune çıkarıldıktan sonra, kloroformu tamamen buharlaşmak için 15 ml'lik şişeyi azot altına yerleştirin. Orijinal numune saklanabilir ve dondurucuya iade edilebilir. Numune kurutulduğunda, 1,5 ml dikloromethane veya o günün erken saatlerinde veya iki pipetle yapılan bir pipetli ve üç mlS Hilditch çözeltisi ekleyin.
Bu çözelti daha sonra azot altında tutulur, girdaplanır ve bir saat boyunca 100 santigrat derecede bir fırına yerlenmeden önce dört dakika boyunca sonicator'a yerleştirilir. Reaksiyonu durduruyor. 100 Santigrat'ta bir saat ısıtılıp soğuduktan sonra, yavaşça 0,5 ml doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin.
Asit nötralize edildikçe kabarcıklar üretilecektir. Daha sonra 1,5 ml hekzan ekleyin. Özetleyin ve kuvvetlice çalkalayın.
İki katmana ayıracak şekilde bekletin. Tüm örnekleri işleyin. Hepsi bittiğinde, ilki bir sonraki adıma hazır olacak.
Üst katman kaldırılıyor. Derivatizasyon durdurulduktan ve 15 ml'lik şişede net bir ayırma olduğunda, üst tabakayı çıkarın ve lipid temiz iki ml'lik bir şişeye yerleştirin. Üst tabakanın bir kısmını bırakıp alt tabakadan herhangi birini iki ml'lik şişeye almaktan daha iyidir.
Üst katmanın çoğu kaldırıldıktan sonra, çözümün geri kalanı atılabilir. İki ml'deki ekstrakt, yumuşak bir azot akışı altında tamamen buharlaştırılmalıdır. Şişe tamamen kuruduktan sonra, heksin okunabilir ve daha sonra numune sonicated, azot altında tutulmalıdır ve daha sonra GC'ye gitmeye hazırdır. Temsili sonuçlar.
Bu rakam, standartımıza ait ham TLC-FIC kromatogramlarını, bu diyeti besleyen bir somon balığından kolza yağı ve karaciğer dokusu ile yapılan bir diyeti göstermektedir. En hızlı büyüyen gıda üretim sektörü olan su ürünleri, yabani kaynaklı balık unu ve balık yağına olan bağımlılığını azaltmak zorundadır. Bitki yağları, su beslemelerindeki balık yağının yerini alacak şekilde araştırılmaktadır.
Ve lipid metabolizmasının birincil bölgesi olan karaciğer, analiz için hedeflenmiştir. Triacylglycerollerin karaciğerdeki diyetteki yaygınlığını ve ayrıca membran fosfolipidlerin karaciğerdeki önemini görebiliriz. Bu şekil bir standardın kromatogramlarını göstermektedir.
Lipitler ve yerleşim parçacıkları kıyıdan burada toplanmış ve misiddeki lipitler aynı derinliğe yakın toplanmış. Burada kromatogramlar çizim yazılımı ile işlenmiştir. Çok yüksek enerji değerine sahip karbon bakımından zengin olan lipitler, özellikle karbon döngüsü için önemli olan raf alanlarının verimliliğinin önemli bir bileşenidir.
Daha fazla yüzey birincil üretimi daha sığ sularda deniz yatağına ulaşır. Küçük mysid'in örneklerimizde en yüksek lipit konsantrasyonuna sahip olduğunu gördük. Balmumu ve steril esterler burada birleştirilir.
Ve yüksek düzeyde çoklu doymamış yağ asitlerinin varlığı nedeniyle pik bölünmesi vardır. Chromarod Iatroscan TLC-FID sisteminin küçük örneklerden sinoptik lipid sınıfı veriler sağlamadaki hızlılığı, daha ayrıntılı kromatografik analizler yapmadan önce deniz örneklerini taramak için güçlü bir araç haline getirir. Bu tür analizler genellikle lipid özlerinden bileşen bileşiklerinin salınmasını ve volatiliteyi artırmak için derivatizasyon gerektirir.
