وتتعلق الأساليب الموصوفة هنا بالمركبات التي يمكن تعريفها من الناحية التشغيلية على أنها دهون بحرية. أساس هذا التعريف هو قابليتها للاستخراج السائل السائل في المذيبات العضوية غير القطبية ، والتي توفر وسيلة مريحة لفصلها عن المركبات الأخرى في مصفوفة مائي. وتسهل طبيعتها الكارهة للماء عزلها عن مياه البحر أو العينات البيولوجية، فضلا عن تخصيبها وإزالة الأملاح والبروتينات.
وبالنسبة لعينات مياه البحر، تنطوي الخطوة الأولى عادة على الفصل إلى كسور مذابة وجسيمات محددة من الناحية التشغيلية، وعادة عن طريق الترشيح. الجسيمات كسر هو أن تحتفظ بها المرشحات، وحجم المسام مهم في تحديد قطع. باستخدام ملقط نظيف للدهون، ضع فلتر ألياف زجاجية عيار 47 ملليمترا تم رماده على نظام ترشيح نظيف للدهون.
خذ العينة ودوامة بلطف لإعادة إنفاق أي جزيئات قد تكون استقرت. قياس حجم معروف. يعتمد الحجم على كمية المواد الجسيمية في العينة.
عندما يتم قياس حجم بها، إضافة شفط إلى نظام الترشيح، والرطب بلطف مرشح مع مياه البحر المصفاة. أضف العينة بأكملها ببطء إلى قمع الترشيح وشطف الأسطوانة المتدرج بماء البحر لضمان إضافة جميع الجسيمات إلى الفلتر. شطف قمع الجهاز لضمان شطف جميع الجسيمات وصولا الى مرشح.
اسحب كل السائل من خلال الفلتر، ولكن لا تدع الفلتر يجف، لأنه يمكن أن يمزق الخلايا الموجودة على الفلتر. تأخذ ملقط الدهون نظيفة، أضعاف مرشح في النصف، ثم أضعاف في الثلثين مرة أخرى، ومن ثم في نصف بالطول. ثم يتم وضع الفلتر في قارورة نظيفة من الدهون.
تغطية مرشح مع اثنين من ملس من الكلوروفورم، غطاء تحت النيتروجين، وختم مع الشريط تفلون. عند هذه النقطة، سوف تكون العينة مستقرة في التخزين عند ناقص 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام. تحضير العينة.
قياس حجم معروف من filtrate في اسطوانة تخرج الزجاج الدهني نظيفة. ضع العينة في قمع فاصل نظيف للدهون ، وأضف ما يقرب من 20 مل من الكلوروفورم. يهز هذا الخليط لمدة دقيقتين على الأقل تنفيس في كثير من الأحيان.
بعد الانفصال الأول، وإزالة استخراج الأول وإضافة حمض. بعد هز الحل لمدة دقيقتين، التفاف القمع في رقائق الألومنيوم والانتظار حتى يحدث الانفصال، ما يقرب من خمس دقائق. بعد انتظار الانفصال، قشر مرة أخرى الجزء السفلي من رقائق الألومنيوم لرؤية الطبقتين.
جمع الطبقة السفلية في قارورة مستديرة القاع نظيفة الدهون، مع الحرص على عدم تضمين أي من الطبقة العليا. قم بوضع قارورة مستديرة القاع تحت النيتروجين، وضعها في الثلاجة. استعادة قمع فاصل وإضافة حمض الكبريتيك إلى السائل.
إضافة 0.25 ملل لكل لتر من مياه البحر الحالية. بمجرد إضافة حمض الكبريتيك، يهز مياه البحر بلطف، ثم إضافة 10 مل أخرى من الكلوروفورم، ويهز بقوة في حين تنفيس لمدة دقيقتين إضافيتين. ثم السماح للانفصال.
الفصل الثاني والثالث. إضافة الطبقة السفلى إلى قارورة أسفل الجولة مرة أخرى دون تضمين الماء. إضافة كمية ثالثة من 10 مل من الكلوروفورم ويهز لمدة دقيقتين أخريين مع تنفيس.
بعد الانفصال، ضع الجزء الأخير من الكلوروفورم في نفس القارورة، ويمكن تبخر المستخلصات المجمعة بواسطة المبخر الدوار ونقلها إلى قارورة مل اثنين. اعداد. لإعداد استخراج، ستحتاج إلى حاوية معزولة مليئة الجليد. وتشمل المذيبات الكلوروفورم، والمياه المستخرجة من الكلوروفورم، و2:1 الكلوروفورم الميثانول.
من هذا الحل، تحتاج إلى ما يقرب من مل واحد لكل عينة، لذلك جعله وفقا لذلك. كل هذه المذيبات يجب أن توضع على الجليد بحيث تكون باردة بحلول الوقت الذي تبدأ عمليات الاستخراج. العينات تذهب أيضا على الجليد بحيث يبقى كل شيء باردا.
طحن واستخراج. وقد تم تخزين العينات المجمدة في اثنين من ملس من الكلوروفورم، لذلك إضافة مل واحد من الميثانول الجليد الباردة أو نصف pipetful. كن حذرا عند إضافة الميثانول عدم لمس القارورة مع pipet.
تنظيف وتجانس ثلاث مرات مع الميثانول وثلاث مرات مع الكلوروفورم. عند الطحن، يجب الحرص على عدم قطع قارورة الاستخراج في يدك في حالة كسر القارورة وتجنب ارتفاع درجة حرارة العينة. طحن بسرعة.
بمجرد أن تكون العينة أرضية تماما ، قف في الثلج واغسل أي جزيئات متبقية من المطحنة مرة أخرى إلى القارورة باستخدام مل من 2:1 الكلوروفورم الميثانول. إذا لزم الأمر، استخدم مجموعة من ملقط الدهون نظيفة لإجبار الجسيمات مرة أخرى إلى القارورة قبل الغسيل. يجب الحرص على عدم لمس ماصة إلى طاحونة أو طاحونة إلى القارورة.
ثم أضف 0.5 مل أو ربع ماصة من الماء المستخرج من الكلوروفورم دون لمس المطحنة أو المطحنة إلى القارورة. عندما يتم غسلها طاحونة، لمس قطرة تتدلى من طاحونة إلى القارورة. كاب والاحتفاظ بها في الجليد حتى تصبح جاهزة ل sonicate.
أنبوب مزدوج. بعد الطرد المركزي، سيكون هناك طبقتين في القارورة: الطبقات العضوية والمياوية. للحصول على طبقة عضوية، يتم استخدام تقنية الأنابيب المزدوجة.
للقيام بذلك ، يتم فهم ماصة قصيرة طولها خمسة سنتيمترات مع المصباح وضعت على فضفاضة بين السبابة والإصبع الأوسط. دفع بلطف pipet أسفل من خلال طبقتين في حين الضغط على لمبة مما تسبب في فقاعات للخروج إلى النهاية. عندما يتم الوصول إلى الجزء السفلي من الطبقة الثانية، استخدم الإبهام لموسيقى البوب لمبة قبالة دون رسم الطبقة العضوية في pipet.
مع أنبوب تسعة سنتيمترات ضغط لمبة تماما. وضع نهاية طويلة من pipet في أنبوب خمسة سنتيمترات وإزالة الطبقة السفلية من خلال أنبوب خمسة سنتيمترات. ثم يتم وضع هذا المقتطف في قارورة نظيفة الدهون.
استمر في خلع الطبقة السفلية حتى تتم إزالتها جميعا. جميع طبقات تجمع في قارورة نظيفة الدهون. غسل الأنابيب.
إزالة لمبة من أنبوب تسعة سنتيمترات. ضعه في القارورة مع المقتطف فيه. تأخذ pipetful من الكلوروفورم نظيفة، ودون لمس ماصة إلى واحد يجري غسلها، بخ الكلوروفورم حول داخل الأنابيب.
بدوره بلطف أن pipet أثناء الغسيل. تأخذ pipetful الثاني من الكلوروفورم وتفعل الشيء نفسه إلى خارج pipet. تأكد من أن كل الكلوروفورم يمتد إلى أسفل الأنابيب وإلى قارورة الاستخراج.
عند الانتهاء مع pipet طويلة، واتخاذ واحدة قصيرة وكرر، ولكن غسل هذا في القارورة مع العينة. اكتشاف عينة. تنظيف حقنة مع الكلوروفورم.
خذ عينة من الحجم المعروف وشطف الحقنة في العينة. اسحب العينة بعد الكمية التي تريد اكتشافها. ثم جلب المكبس وصولا الى المبلغ الذي تريد ضمان عدم وجود فقاعات الهواء.
استخدام الزر للاستغناء عن 0.5 ميكرولتر ولمس قطرة إلى قضيب. السماح لتجف قبل وضع قطرة المقبل على نفس المكان. بقعة جميع العينات في خط على قضبان عقد على نهاية لوحة ساخنة دافئة.
التركيز في الأسيتون. يتم تركيز العينة في الأسيتون 100٪. إضافة ما يقرب من 70 مل من الأسيتون إلى الجزء السفلي من خزان التنمية.
تأخذ اثنين من رفوف وخفض بلطف لهم في خزان التنمية. مشاهدة الجبهة المذيبات كما أنه يتسلق قضيب حتى الجزء السفلي من بقعة يدمج مع الجزء العلوي من المكان. إزالة قضبان.
جففها لمدة خمس ثوان تقريبا، ثم كرر الإجراء. إذا كانت العينات مركزة جدا، يمكن القيام بهذا التركيز مرة ثالثة. أول نظام تطوير.
يتكون نظام التطوير الأول من الهيكسان والإيثيل الأثيري وحمض الفورميك في 98.5 إلى 0.5. ابدأ بشطف أسطوانة متدرجة ثلاث مرات بالهيكسان والتخلص منه. ملء اسطوانة تخرج قليلا وراء 85 mls مع hexane.
ثم استخدم ماصة وزجاجة من الهيكسان لملء اسطوانة تخرج إلى 90 mls. ثم جلب الجزء السفلي من الغضروف المفصلي إلى خط 91 مل باستخدام الأثير الإيثيلي، والتي سوف تعطي مل واحد من الأثير الإيثيل. إضافة 0.5 مل من حمض الفورميك باستخدام حقنة هاملتون.
ولكن أولا شطف حقنة هاملتون ثلاث مرات مع حمض الفورميك لضمان عدم وجود الكلوروفورم التي كانت تستخدم لشطف العينة من الحقنة لا يزال قائما. إضافة اثنين من المحاقن كاملة أو 25 ميكرولتر في وقت واحد لما مجموعه 50 ميكرولتر. من المهم أن يتم شطف حمض الفورميك من الحقنة على الفور مع الكلوروفورم لتجنب تآكل المعدن في الحقنة.
مرة واحدة في حقنة هاملتون نظيفة، وجعل الحل يصل إلى بالضبط 100 mls باستخدام الهيكسان وماصة. ثم كاب وعكس ثلاث أو أربع مرات. صب في ما يقرب من 30 mls في خزان التنمية.
استخدام هذا 30 mls لتبلل ورقة وشطف الخزان. تجاهل محلول الشطف. إضافة 70 mls المتبقية إلى خزان التنمية.
إضافة رفوف إلى نظام التطوير. إضافة قضبان إلى نظام التنمية هو نفسه بالنسبة لكل تطور. تأكد من ضبط المؤقت للوقت الذي سيتم فيه تطوير القضبان.
ثم تأخذ الرفوف وخفض بلطف لهم في الخزان. شاهد حتى تصل الجبهة المذيبة إلى بقع العينة، ثم ابدأ المؤقت. نظام التطوير الثاني.
نظام التطوير الثاني هو الهيكسان والإيثيلين وحمض الفورميك ، من 79 إلى 20 إلى واحد. حتى كما كان من قبل، شطف اسطوانة تخرج ثلاث مرات مع الهيكسان. إضافة بالضبط 20 مل من الأثير ومن ثم مل واحد من حمض الفورميك، مما يجعل حجم إلى 21 مل.
ثم جلب حجم إلى 100 مل مع الهيكسان. إضافة حوالي 75 مل من الهيكسان باستخدام مضخات زجاجة. وبالنسبة للجزء، استخدم ماصة.
كاب وعكس عدة مرات. أضف حوالي 30 مل إلى خزان التطوير لتبلل الورقة وشطف الخزان. تجاهل 30 mls.
إضافة 70 المتبقية وانها مستعدة لمجموعة من قضبان. نظام التنمية الثالث. نظام التطوير الثالث هو مزيج من الكلوروفورم والميثانول والمياه المستخرجة من الكلوروفورم، 50، 40 إلى 10.
شطف اسطوانة تخرج ثلاث مرات مع الكلوروفورم. إضافة حوالي 45 مل من الكلوروفورم. باستخدام ماصة، وجلب الجزء السفلي من الغضروف المفصلي إلى علامة 50 مل.
إضافة حوالي 38 مل من الميثانول. جلب الجزء السفلي من الغضروف المفصلي إلى خط 90 مل. ثم ملء آخر 10 ملس مع المياه المستخلصة من الكلوروفورم.
كما هو الحال مع أنظمة التطوير الأخرى ، عكس هذا ثلاث أو أربع مرات ، ومن ثم صب 30 مل في الخزان لتبلل الورق. تجاهل أن 30 mls وإضافة آخر 70 mls في الخزان. إعداد الميثانول.
لتعويض محلول Hilditch المستخدم في الاشتقاق ، قم بملء قارورة حجمية نظيفة من الدهون تم تجفيفها أو شطفها ثلاث مرات إضافية بالميثانول لإزالة أي الكلوروفورم. إضافة الميثانول حتى الجزء السفلي من الغضروف المفصلي هو في لاحتواء الخط. بعد قياس الميثانول، أضف كبريتات الصوديوم التي تم تجفيفها لمدة 24 ساعة على الأقل عند 60 درجة مئوية.
إضافة ما يكفي من كبريتات الصوديوم بحيث يغطي الجزء السفلي من قارورة متري حجم. مرة واحدة مغطاة، عكس مرتين بحيث يتم امتصاص أي المياه التي في الميثانول من كبريتات الصوديوم. بعد عكس والهز، والسماح لها الجلوس لمدة خمس دقائق على الأقل.
إضافة حمض. بعد أن يستقر الميثانول خمس دقائق ، قم ببطء بفكه في الزجاجة النهائية لضمان بقاء جميع كبريتات الصوديوم في الجزء السفلي من القارورة الحجمية. عادة ما يبقى كبريتات الصوديوم في القاع ، لذلك يجب أن يصب كل الميثانول.
اترك الحجم مع كبريتات الصوديوم في الجزء الخلفي من غطاء الدخان لتجف. إضافة حمض الكبريتيك ببطء إلى الميثانول باستخدام PIPETMAN. إضافة بضع قطرات في وقت واحد حتى الميثانول لا يبصق.
مرة واحدة وقد أضيفت جميع حمض، وقبعة ويحرك بلطف لخلط. الحل جاهز الآن لاستخدامه في المشتقات، ولكن يجب أن يتكون على أساس أسبوعي. صنع المشتقات.
من قارورة استخراج التي كان حجم جلبت ما يصل الى كمية معروفة، دوامة، ثم إزالة جزء من استخراج في قارورة نظيفة الدهون، ملحوظ 15 مل. سيتم تحديد الكمية التي قمت بإزالتها بتركيز العينة من إياتروسكان. استخدام الدهون نظيفة دروموند pipet لإزالة العينة.
بمجرد إزالة العينة ، ضع القارورة التي يبلغ 15 مل تحت النيتروجين لتتبخر تماما الكلوروفورم. يمكن الاحتفاظ بالعينة الأصلية وإعادتها إلى الثلاجة. عندما يتم تجفيف العينة، إضافة 1.5 مل من ثنائي كلورو الميثان أو واحد pipetful وثلاثة مل من محلول Hilditch التي تم إجراؤها في وقت سابق من ذلك اليوم أو اثنين من pipetfuls.
ثم يتم الاحتفاظ بهذا الحل تحت النيتروجين، دوامة ووضعها في sonicator لمدة أربع دقائق قبل وضعها في الفرن في 100 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وقف رد الفعل. بعد التدفئة في 100 مئوية لمدة ساعة والتبريد، إضافة ببطء 0.5 مل من محلول بيكربونات الصوديوم المشبعة.
وسيتم إنتاج فقاعات كما يتم تحييد حمض. ثم أضف 1.5 مل من الهيكسان. خلاصة ويهتز بقوة.
دعه يقف بحيث ينفصل إلى طبقتين. معالجة كافة العينات. بحلول الوقت الذي ينتهون فيه جميعا، سيكون الأول جاهزا للخطوة التالية.
إزالة الطبقة العليا. بمجرد توقف الاشتقاق وهناك فصل واضح في القارورة 15 مل ، قم بإزالة الطبقة العليا ووضعها في قارورة نظيفة من الدهون ذات ملين. فمن الأفضل أن تترك بعض الطبقة العليا من والحصول على أي من الطبقة السفلية في قارورة مل اثنين.
بمجرد إزالة معظم الطبقة العليا، يمكن تجاهل بقية الحل. وينبغي أن يتبخر المقتطف الذي هو في اثنين مل تماما تحت تيار لطيف من النيتروجين. مرة واحدة في القارورة جافة تماما، يمكن إعادة إضافة الهيكسان، ومن ثم ينبغي أن تكون سونيكاتيد العينة، وأبقى تحت النيتروجين، ومن ثم أنها على استعداد للذهاب إلى GC. النتائج التمثيلية.
يظهر هذا الرقم كروماتوجرامات TLC-FIC الخام من معيارنا ، وهو نظام غذائي مصنوع من زيت بزيت اللفت وأنسجة الكبد من سمك السلمون الذي يغذي هذا النظام الغذائي. وتربية الأحياء المائية، وهي أسرع قطاعات إنتاج الأغذية نموا، يجب أن تقلل من اعتمادها على دقيق السمك البري المصدر وزيت السمك. ويجري التحقيق في الزيوت النباتية كبديل لزيت السمك في الزيت المائي.
والكبد، الموقع الرئيسي لعملية التمثيل الغذائي للدهون، مستهدف للتحليل. يمكننا أن نرى انتشار triacylglycerols في النظام الغذائي في الكبد، وأيضا أهمية الفوسفوليبيدات الغشاء في الكبد. يظهر هذا الشكل اللونيات لمعيار.
الدهون والجزيئات تسوية جمعت قبالة الساحل هنا والدهون في mysid جمعت بالقرب من نفس العمق. هنا ، تمت معالجة الكروماتوجرامات من خلال رسم البرامج. ونظرا لكونها غنية بالكربون ذات قيمة عالية جدا من الطاقة، فإن الدهون عنصر مهم في إنتاجية مناطق الجرف، والتي لها أهمية خاصة لركوب الدراجات الكربونية.
ويصل المزيد من الإنتاج الأولي السطحي إلى قاع البحر في مياه أقل عمقا. وجدنا أن الميد الصغير كان لديه أعلى تركيز للدهون في عيناتنا. الشمع والإيسترات العقيمة مجتمعة هنا.
وهناك ذروة تقسيم بسبب وجود مستويات عالية من الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة. السرعة التي يوفر بها نظام Chromarod Iatroscan TLC-FID بيانات فئة الدهون الشاملة من عينات صغيرة تجعلها أداة قوية لفحص العينات البحرية قبل إجراء تحليلات كروماتوغرافية أكثر تفصيلا. وتتطلب هذه التحليلات عادة إطلاق مركبات مكونة من مستخلصات الدهون واشتقاقها لزيادة التقلب.
